饲料青贮是指在厌氧密闭环境中，乳酸菌大量繁殖，可将饲料中的淀粉和可溶性糖变为乳酸的过程。乳酸含量积累到一定水平后，会抑制腐败菌的繁殖生长，微生物活动逐渐变弱，从而长期保存青贮饲料的营养成分，且青贮饲料具有较好的适口性[1]。玉米和三叶草在西藏种植较多，玉米秸秆质地坚韧，粗纤维含量高，粗蛋白含量低，适口性比较差[2-3]；三叶草属于豆科牧草，粗蛋白含量较高，粗纤维含量低[4-5]。若将玉米和三叶草单独青贮，青贮成功难度较大，无法制作品质优良的青贮饲料，因此常采用混合青贮的方式提高青贮品质，以克服单独青贮的缺点[6]。有研究表明，青贮饲料中微生物菌群丰度、结构会影响青贮发酵的过程及青贮饲料品质[7]。近年来，高通量测序技术在青贮饲料微生物多样性研究中应用较多[8]。本试验借助高通量测序技术，研究全株玉米和三叶草不同比例混合青贮对青贮饲料微生物菌群多样性的影响，为提高三叶草的饲用价值提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验于西藏农牧学院草业实习基地进行。刈割乳熟期全株玉米和三叶草作为试验材料，将全株玉米和三叶草剪成2~3 cm小段，阴凉地晾至合适水分后，将全株玉米和三叶草按照1∶2、1∶1、2∶1混匀。各比例全株玉米和三叶草混匀后分为2份，一份密封，置于冰箱中保存；另一份压紧密封，在小型青贮罐中发酵60 d。1.2试验设计试验采取单因素试验设计，设置6个处理组，A组、B组、C组为正常混合组，全株玉米和三叶草分别按照1∶2、1∶1、2∶1混匀；D组、E组、F组为混合青贮组，全株玉米和三叶草分别按照1∶2、1∶1、2∶1混匀青贮发酵，每个处理5个重复，共30个样品。1.3测定指标及方法1.3.1青贮饲料感官评定感官评定参照德国农业协会推荐评分方法[9]进行，德国农业协会青贮饲料感官评定标准见表1。开启青贮罐后，去除表层饲料，将所有青贮料从青贮罐中取出，混匀，从气味、质地、色泽等3个方面进行评定，16~20分为1级（优），10~15分为2级（良），5~9分为3级（中等），0~4分为4级（腐败）。将所有的青贮料烘干，粉碎，置于密封袋中冷冻保存。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.023.T001表1德国农业协会青贮饲料感官评定标准项目评分标准得分气味有芳香果味或明显的面包香味14有微弱的丁酸臭味，或较轻的酸味，芳香味弱10丁酸味颇重，或有刺鼻的焦煳臭或霉味4有较强的丁酸臭味或氨味，或几乎无酸味2质地茎叶结构保持良好4茎叶结构保持较差2茎叶结构保持极差或有轻度的霉菌污染1茎叶腐烂或污染严重0色泽与原料相似，烘干后呈淡褐色2略有变色呈淡黄色或带褐色1变色严重，墨绿色或褐色呈黄色，霉味较强01.3.2常规营养成分饲料青贮前后水分、干物质、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪等指标测定参照张丽英[10]的方法。采用pH测定仪（Five Easy Plus，上海梅特勒-托利多仪器有限公司）测定混合青贮饲料发酵后pH值，苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮（NH3-N）含量[11]。1.3.3青贮饲料微生物多样性青贮饲料微生物多样性样品会送至上海派森诺生物科技股份有限公司进行测序分析，利用正向引物（F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和反向引物（R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）对细菌16s rRNA基因V3-V4区进行测定。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel软件进行统计，SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。采用dada2去噪、聚类获得OTU，进行物种分类学结果注释；采用QIIME2分析软件对各青贮处理在不同物种分类学水平上的组成进行描述。2结果与分析2.1全株玉米与三叶草混合青贮的感官评价结果（见表2）由表2可知，3个青贮组的青贮饲料均略有变色，呈淡黄色，在色泽上无明显差别，无霉变情况发生；茎叶结构保持较为良好，有芳香气味，略带酸味。3个比例青贮饲料的感官评分等级均为良好等级以上，其中E组（全株玉米∶三叶草=1∶1）的感官评价分数最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.023.T002表2全株玉米与三叶草混合青贮的感官评价结果组别色泽气味质地得分等级D组193132（良）E组1123161（优）F组1103142（良）2.2全株玉米和三叶草混合青贮前后常规营养成分分析（见表3）由表3可知，D组、E组、F组青贮饲料的粗灰分、粗脂肪含量均显著高于青贮前（P0.05），干物质、粗纤维、粗蛋白含量显著低于青贮前（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.023.T003表3全株玉米和三叶草混合青贮前后常规营养成分分析组别干物质粗灰分粗脂肪粗纤维粗蛋白A组24.61±1.74b7.32±0.27e3.23±0.36b22.56±0.42c13.20±0.13fD组21.12±0.27a7.60±0.33f4.07±0.37c21.74±1.60bc12.66±0.02eB组26.81±1.91c6.12±0.40c3.33±0.30b24.80±1.88d11.16±0.21dE组24.98±1.21b6.39±0.15d4.25±0.51c20.07±0.79ab10.55±0.05cC组29.58±1.38d5.23±0.28a2.34±0.47a21.40±0.84abc8.57±0.23bF组24.61±1.21b5.71±0.11b3.53±0.42b19.55±0.40a7.74±0.04a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。%2.3全株玉米和三叶草混合青贮对发酵品质的影响（见表4）由表4可知，E组青贮饲料的pH值显著低于其他组（P0.05），NH3-N含量显著低于F组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.023.T004表4全株玉米和三叶草混合青贮对发酵品质的影响组别pH值NH3-N/(mg/dL)D组3.69±0.03c4.63±0.27abE组3.58±0.03a4.14±0.17aF组3.64±0.02b4.78±0.30b2.4全株玉米与三叶草混合青贮微生物多样性分析2.4.1高通量测序测序结果（见图1、图2）本研究利用高通量测序技术，对30个青贮饲料样本的16S基因V3-V4区测序，共获得2 831 264条有效序列，序列平均长度为418.26 bp。由图1可知，随着测试深度的不断加深观察到的物种稀疏曲线逐渐增加，各青贮组到达一定抽平深度，稀释曲线逐渐平缓，趋于平台期不再增加，表明测序量已经达到饱和，青贮组中绝大多数菌种被覆盖，测序结果能反映当前样本所包含的菌群多样性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.023.F001图1各青贮组稀疏曲线结果由图2可知，通过对各个青贮样本在门、纲、目、科、属、种6个分类学水平上的鉴定，共鉴定出420个门、704个纲、1 544个目、2 633个科、4 987个属、2 234个种，并统计相对丰度大于1%的微生物菌群。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.023.F002图2各水平分类单元数2.4.2全株玉米与三叶草混合青贮Alpha多样性分析结果（见图3）由图3可知，各组Chao1、Shannon、Simpson、Pielou、Goods coverage指数具有显著差异（P0.05），表明混合青贮使微生物菌群的丰富度、多样性及均匀度等发生改变；Faith指数无显著差异（P0.05），表明混合青贮使得微生物菌群的进化多样性趋于一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.023.F003图3全株玉米与三叶草混合青贮Alpha多样性分析结果2.4.3全株玉米与三叶草混合青贮Beta多样性分析结果（见图4）由图4可知，PCo1的贡献率为55.0%，PCo2的贡献率为11.6%，混合青贮前组（A组、B组、C组）分布在第二、三象限，混合青贮后组（D组、E组、F组）分布在第一、四象限，且D组、E组、F组微生物菌群聚集度较高，表明混合青贮能够提高微生物菌群相似度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.023.F004图4全株玉米与三叶草混合青贮微生物菌群Beta多样性分析结果2.4.4全株玉米与三叶草混合青贮物种差异及标志物种分析结果（见图5）由图5可知，C组特有OTU占比最高，为28.50%；E组特有OTU占比最低，为8.22%；A组、B组、C组、D组、E组、F组共有OTU占比1.43%。研究表明，混合青贮能够降低OTU数目，共有OTU数目占比低，OTU数目降幅最大的为D组（全株玉米∶三叶草=1∶2），降幅最小的为F组（全株玉米∶三叶草=2∶1）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.023.F005图5全株玉米与三叶草混合青贮微生物菌群OTU Venn图2.4.5全株玉米与三叶草混合青贮对门水平微生物菌群结构的影响（见表5）由表5可知，门水平上，混合青贮后相对丰度较高的3个菌门为厚壁菌门、蓝藻菌门和变形菌门，厚壁菌门相对丰度最高。混合青贮后，青贮饲料的厚壁菌门相对丰度显著高于青贮前（P0.05），E组增加幅度最大，混合青贮后青贮饲料的蓝藻菌门和变形菌门相对丰度显著低于青贮前（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.023.T005表5全株玉米和三叶草混合青贮对门水平微生物菌群结构的影响组别厚壁菌门蓝藻菌门变形菌门放线菌门拟杆菌门Deinococcus-ThermusA组2.20±2.24a68.18±9.45c22.82±7.58b3.06±1.292.93±2.21ab0.24±0.21abB组0.47±0.36a80.77±12.28c13.43±8.48ab2.72±2.051.59±0.97ab0.75±1.22abC组1.36±0.81a38.01±5.70b49.73±23.63c3.89±2.445.07±5.85b1.43±1.71bD组87.16±5.66c4.77±4.28a6.24±2.14ab0.59±0.291.02±0.57a0.01±0.01aE组92.81±4.34c1.03±0.42a4.52±3.24a0.41±0.230.88±0.46a0.18±0.32aF组70.79±19.84b1.42±1.24a21.37±13.59ab3.93±7.331.79±1.65ab0.12±0.18a2.4.6全株玉米与三叶草混合青贮对属水平微生物菌群结构的影响（见表6）由表6可知，属水平上，混合青贮后各组相对丰度较高的菌属是乳酸杆菌属、叶绿体属、明串珠菌属，乳酸杆菌属相对丰度最高。混合青贮后，乳酸杆菌属相对丰度显著高于青贮前（P0.05），E组增加幅度最大；混合青贮后叶绿体属相对丰度显著低于青贮前（P0.05），明串珠菌属相对丰度显著高于青贮前（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.023.T006表6全株玉米和三叶草混合青贮对属水平微生物菌群结构的影响组别乳酸杆菌属叶绿体属明串珠菌属甲基杆菌属乳球菌属A组0.38±0.31a68.15±9.47c0.02±0.02a6.65±5.59b0.04±0.04aB组0.08±0.06a80.76±12.29c0.05±0.03a3.82±2.31ab0.11±0.19aC组0.12±0.05a38.00±23.97b0.10±0.08a4.00±2.12ab0.14±0.15aD组71.60±13.25c4.76±4.28a5.55±6.51ab0.87±0.25a7.64±7.08bE组79.88±10.10c1.03±0.42a6.76±6.51b0.75±0.69a4.72±2.89bF组56.54±15.81b1.41±1.24a7.94±5.42b1.44±1.65a4.11±1.03ab3讨论3.1全株玉米与三叶草混合青贮感官评价分析青贮饲料感官评价的指标包括色泽、气味、质地结构等[12]。本试验中，3种青贮饲料均略有变色，呈淡黄色，色泽上无明显差别，无霉变情况发生；茎叶结构保持较为良好，具有芳香气味，略带酸味；且全株玉米∶三叶草=1∶1混合青贮的感官评价分数较高，为1级。3.2全株玉米与三叶草混合青贮营养品质分析西藏地处我国西南部，地理位置和生态条件较特殊，畜牧业占比较大，但草地退化、牧草产量低导致牛羊等牲畜饲草料资源缺乏，草畜矛盾不断加重[13]。本试验发现，各混合青贮组青贮饲料的干物质含量均不同程度地降低，原因是微生物发酵底物降解青贮饲料的消耗造成[14]。本试验中，不同比例混合青贮组青贮饲料的粗灰分、粗脂肪含量显著升高，粗纤维、粗蛋白含量显著降低，其中全株玉米∶三叶草=1∶1混合青贮组粗纤维含量降幅最大，表明该混合青贮组能够有效保存饲料原料的营养价值，降低饲草中纤维含量，从而增加动物采食量。3.3不全株玉米和三叶草混合青贮对发酵品质的影响本试验中，各混合青贮组发酵pH值均在3.7以下，符合优质青贮饲料的标准[15-16]。青贮发酵时，全株玉米中含有的可溶性碳水化合物被微生物降解利用，会产生大量乳酸，使pH值降低，从而抑制有害微生物及腐败菌生长繁殖，饲草营养价值得以长期保存，与玉柱等[17]研究结果一致。pH值越低，发酵效果越好、品质越佳[14]；发酵液中NH3-N含量越低，表明发酵中饲料被降解的蛋白质越少，可被动物利用蛋白质越多，青贮饲料品质越高[18-20]。本试验中，全株玉米∶三叶草=1∶1混合青贮组青贮饲料的pH值及NH3-N含量较低，发酵品质更佳。3.4全株玉米和三叶草混合青贮对微生物菌群丰度及结构的影响青贮饲料发酵过程中微生物菌群的丰度和结构也会影响青贮饲料的发酵品质[17]。本试验中，由Alpha多样性指数可知，全株玉米和三叶草混合比例不同，青贮饲料中微生物菌群的丰度和结构发生变化。本研究中共检测到相对丰度大于1%的微生物菌群有6种菌门和10种菌属，优势菌门依次为厚壁菌门、变形菌门、蓝藻菌门，优势菌属依次为乳杆菌属、叶绿体属、明串珠菌属（属于LAB菌种），表明混合青贮增强了饲料产乳酸的能力，降低了饲料pH值，饲料营养成分维持在较高水平，损失较少、饲喂动物价值更高。本试验中，全株玉米∶三叶草=1∶1混合青贮组中青贮饲料中厚壁菌门和乳杆菌属的丰度高于其他两组，表明该混合青贮组降解粗纤维和产生乳酸的能力更强[21-22]，能够降低青贮饲料的pH值，有效抑制有害杂菌生长。4结论本研究结果显示，全株玉米∶三叶草=1∶1混合青贮组感官评价分数较高、pH值及NH3-N含量较低、厚壁菌门和乳杆菌属丰度较高，最大程度保存了饲料营养成分。