随着母猪品种的改良，母猪产仔数量已经达到30头以上，仅通过提高采食量改善母猪泌乳能力已经很难满足仔猪的营养需求，而母乳不足会造成仔猪断奶重低、应激强烈。在这种情况下，在仔猪日粮中添加奶粉或人工饲喂液态奶可提高仔猪的日增重和存活率[1-3]。因此，仔猪专用补充奶粉的需求量越来越大，乳脂替代品具有较大的市场需求。甘油三酯中的1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（OPO）是最受关注乳脂替代品之一，其与胆酸形成乳糜微粒，不形成不溶性钙皂，减少便秘，易于钙镁离子吸收，是奶粉的首选油脂[4-5]。目前，OPO主要用酶法生产，但是此方法存在酰基位移，导致同分异构体的产生，而微生物合成油脂不存在酰基位移的问题[6-7]。浑浊红球菌PD630是从土壤中分离出来的革兰氏阳性放线菌，在氮源缺乏、碳源充足的条件下可将碳源以甘油三酯的形式储存在细胞内的脂滴（LD）中[8-10]，甘油三酯含量可达细胞干重的87%以上[11-13]。通过碳源调控，浑浊红球菌可以发酵合成OPO，且产量处于中等水平，在仔猪专用补充奶粉研发领域具有潜在的研究价值[14]。LPD06283蛋白是浑浊红球菌LD的结构蛋白，可以调控LD的大小和数目[15]。本研究应用生物信息学方法，对浑浊红球菌PD630脂滴蛋白LPD06283的结构和相互作用蛋白质进行分析，并探讨其可能的生物学功能，为研究LPD06283蛋白在浑浊红球菌脂质代谢调节中的作用机制、开发OPO高产基因工程菌株提供参考。1材料与方法1.1试验材料脂滴蛋白序列从Uniprot数据库获取，信息见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.017.T001表1脂滴蛋白序列信息蛋白名称物种条目标识符LPD06283浑浊红球菌PD630E0ADE6MLDS红球菌RHA1Q0SEX5BCG1169c牛分枝杆菌BCGA0A0H3M379LPAAT裂殖酵母972Q9US27LDP1圆红冬孢酵母NP11M7WE51LDSP微拟球藻CCMP1779H6WNF3MLDP巴夫杜氏藻G9L6P6HOGP湖泊红球藻E2JF04MLDP莱茵衣藻A8J816Oleosin花生Q9AXI0PLIN1猪Q2TCH2PLIN2猪Q9MZE5PLIN3猪Q5BLZ2PLIN4猪F1S7K4PLIN5猪B1PHQ91.2测定指标及方法1.2.1不同物种LD蛋白的理化性质分析将不同物种LD蛋白的氨基酸序列（单字母氨基酸缩写格式）依次提交至ProtParam在线软件，分析氨基酸数目、相对分子质量、带电荷氨基酸数目、蛋白质理论等电点、不稳定指数、脂肪指数和亲水性平均值。1.2.2LPD06283蛋白亲水性、疏水性及双亲性α螺旋分析将LPD06283蛋白的氨基酸序列（单字母氨基酸缩写格式）提交至ProtScale在线软件，采用Hphob./Kyte & Doolittle算法分析氨基酸的亲水性和疏水性，采用HeliQuest服务器对提交的LPD06283蛋白的氨基酸序列（单字母氨基酸缩写格式）进行双亲性α螺旋分析。1.2.3不同物种LD蛋白的同源性分析将不同物种LD蛋白的氨基酸序列（Fasta格式）载入MEGA 11.0软件，选择Clustal W法进行序列比对，将比对结果保存为mega格式并载入MEGA 11.0；选择邻接法构建遗传进化树，检验方法为Bootstrap法，检验次数为500次，替换模型为P-distance，不同位点的进化速率相同，空位处理选择部分删除，阈值设置为50%。1.2.4LPD06283蛋白的信号肽、跨膜区分析将LPD06283蛋白的氨基酸序列（Fasta格式）分别提交至Signal P5.0服务器和Tmhmm在线软件，预测蛋白质的信号肽和跨膜区。1.2.5LPD06283蛋白的二级结构、结构域和三级结构分析将LPD06283蛋白的氨基酸序列（单字母氨基酸缩写格式）分别提交至Sopma软件、Pfam数据库、Robetta服务器进行二级结构、结构域和三级结构分析，并应用SAVES 6.0中的Procheck评估软件进行质量评估。1.2.6LPD06283蛋白的磷酸化修饰位点分析将LPD06283蛋白的氨基酸序列（Fasta格式）提交至NetPhos 3.1在线软件，选择预测位点类型为丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基，设阈值为0.5。1.2.7LPD06283蛋白的相互作用蛋白质分析将LPD06283蛋白的氨基酸序列（Fasta格式）提交至STRING数据库，选择物种Rhodococcus opacus，分析LPD06283蛋白的相互作用蛋白质并计算相互作用综合得分。数据库及软件信息见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.017.T002表2数据库及软件信息名称功能地址Uniprot搜索蛋白质序列https://www.uniprot.orgProtParam理化性质分析https://web.expasy.org/protparam/ProtScale亲水性和疏水性分析https://web.expasy.org/protscale/HeliQuest双亲性α螺旋分析https://heliquest.ipmc.cnrs.fr/Signal P 5.0信号肽分析https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0Tmhmm跨膜区分析https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0Sopma二级结构分析https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.htmlPfam结构域分析http://pfam.xfam.org/Robetta三级结构预测https://robetta.bakerlab.org/submit.phpSAVES 6.0拉式图分析https://saves.mbi.ucla.eduNetPhos 3.1磷酸化位点分析https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1STRING相互作用蛋白质分析https://www.string-db.org/2结果与分析2.1不同物种LD蛋白的理化性质分析按照从低等生物到高等生物的顺序，分别选取浑浊红球菌PD630、红球菌RHA1、圆红冬孢酵母NP11、湖泊红球藻和猪的LD蛋白作为研究对象，依次为LPD06283、MLDS、LDP1、HOGP、PLIN2。采用ProtParam在线软件依次分析上述LD蛋白的理化性质，结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.017.T003表3不同物种LD蛋白的理化性质分析项目LPD06283MLDSLDP1HOGPPLIN2氨基酸数目/个276276265275459相对分子质量28 484.8028 483.8229 499.2529 780.9450 248.90负电荷氨基酸/个4949352749正电荷氨基酸/个3839292649理论等电点4.914.975.936.527.08不稳定指数/分33.6635.0546.8923.9346.47脂肪指数/分84.7883.7388.7283.7882.83亲水性平均值/分-0.355-0.370-0.504-0.131-0.385由表3可知，与PD630、RHA1、NP11和湖泊红球藻相比，猪LD蛋白的氨基酸数目、相对分子质量增大；从PD630、RHA1、NP11、湖泊红球藻到猪，LD蛋白等电点从酸性逐渐变为中性；猪LD蛋白具有最多的带电荷残基，湖泊红球藻LD蛋白具有最少的带电荷残基；PD630、RHA1和湖泊红球藻LD蛋白不稳定指数小于40，属于稳定蛋白，NP11和猪LD蛋白的不稳定指数大于40，属于不稳定蛋白；上述5个物种LD蛋白的脂肪指数均在80~90之间，亲水性平均值小于0，均为亲水性蛋白。研究表明，哺乳动物LD蛋白与细菌、真菌和藻类LD蛋白的理化性质有较大差异，这可能与进化中蛋白质生物活性的改变相关。2.2LPD06283蛋白的亲水性和疏水性以及双亲性α螺旋分析蛋白质的亲疏水性会影响其构象与定位，LPD06283蛋白的亲水性和疏水性分析结果见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.017.F001图1LPD06283蛋白的亲水性和疏水性分析结果由图1可知，第122位的天冬氨酸亲水性最强，得分为-2.211分；第27位的丙氨酸、第28位的缬氨酸疏水性最强，得分均为1.956分。在268个氨基酸（从第5~272位）中，89个氨基酸得分大于0分，属于疏水性氨基酸，占比为33.21%；179个氨基酸得分小于0分，属于亲水性氨基酸，占比为66.79%。表明LPD06283蛋白的亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，总体属于亲水性蛋白质，与亲水性平均值结果相符；疏水性最强的区域位于N端第13~33位氨基酸之间。为进一步分析该区域的特征，采用HeliQuest服务器预测LPD06283蛋白的双亲性α螺旋，见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.017.F002图2LPD06283蛋白的双亲性α螺旋分析结果由图2可知，第14～31位氨基酸序列形成一个双亲性α螺旋，其中疏水面序列为：VAAAVVAVGLVVA，该序列可能是LPD06283蛋白的LD定位序列。2.3不同物种LD蛋白的同源性分析（见图3）由图3可知，LPD06283蛋白与MLDS蛋白处于同一分支的概率是100%，进化距离最小，亲缘关系最近，表明二者的氨基酸序列相似度很高，可能具有相似的功能；LPD06283蛋白与BCG1169c蛋白亲缘关系较近，表明细菌LD蛋白具有较高的保守性；LPD06283蛋白与猪、酵母、藻类、花生的LD蛋白亲缘关系较远，表明在进化中LD蛋白的功能逐渐改变；猪PLIN1、PLIN2、PLIN3、PLIN5亲缘关系较近，巴夫杜氏藻MLDP、湖泊红球藻HOGP、莱茵衣藻MLDP亲缘关系较近，表明LD蛋白在同一或相近物种内的功能是保守的。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.017.F003图3不同物种LD蛋白的同源性分析结果2.4LPD06283蛋白的信号肽、跨膜区分析结果信号肽位于蛋白质的N端，一般由16~26个残基组成，可将蛋白质引导定位至不同的细胞器，LPD06283蛋白的信号肽分析结果见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.017.F004图4LPD06283蛋白的信号肽分析结果由图4可知，LPD06283蛋白具有信号肽的可能性为0.080 0，具有双精氨酸转移（TAT）信号肽的可能性为0.028 1，具有脂蛋白信号肽的可能性为0.003 9，为其他类型蛋白质的可能性是0.888 0，表明其没有信号肽，可能是其他类型蛋白质。膜蛋白分为外在膜蛋白、内在膜蛋白和脂锚定膜蛋白3种类型，其中内在膜蛋白为跨膜蛋白，具有胞质外结构域、跨膜结构域和胞质内结构域，LPD06283蛋白的跨膜区分析结果见图5。由图5可知，跨膜区分析结果表明LPD06283蛋白不含有跨膜区，但N端存在嵌入膜内的区域，表明LPD06283蛋白不是内在膜蛋白，可能是外在膜蛋白。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.017.F005图5LPD06283蛋白的跨膜区分析结果2.5LPD06283蛋白的二级结构、结构域和三级结构分析LPD06283蛋白的二级结构、结构域、三级结构和拉式图分析见图6。由图6可知，蛋白质的二级结构是多肽主链的局部规则构象，主要类型为α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲。由图6（a）可知，LPD06283蛋白的二级结构分析结果显示：LPD06283蛋白由3种二级结构组成，分别为α螺旋（81.88%）、β转角（3.62%）和无规则卷曲（14.49%），表明LPD06283蛋白主要由α螺旋构成，β转角和无规则卷曲可能起到连接各个螺旋束的作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.017.F006图6LPD06283蛋白的二级结构、结构域、三级结构和拉式图分析结果采用Pfam数据库分析LPD06283蛋白的结构域。由图6（b）可知，LPD06283蛋白含有1个apolipoprotein结构域，位于第26~107位氨基酸之间，说明LPD06283蛋白是一个LD结构蛋白。采用Robetta服务器预测得到LPD06283蛋白的三级结构。由图6（c）可知，LPD06283蛋白具有4个螺旋束，当其定位于LD的球形表面时，在曲率的影响下可能会将折叠的螺旋束松开，从而形成环状结构包裹在LD的表面。为进一步对该模型进行质量评估，确定模型是否可靠，研究对LPD06283蛋白的三级结构模型进行了拉式图分析。由图6（d）可知，三级结构拉式图中，99.2%的残基位于红色的允许区域（A、B、L区）和正黄色的额外允许区域（a、b、l、p区）内，0.8%的残基位于浅黄色的最大可接受区域（~a、~b、~l、~p区）内，即第263位缬氨酸（Val）和第86位亮氨酸（Leu），无氨基酸残基位于白色的不允许区域内。因此，LPD06283蛋白的氨基酸残基形成的Cα两面角（φ角和ψ角）均处于合理的可接受状态，预测模型自身合理性较高。2.6LPD06283蛋白的磷酸化修饰位点分析（见图7）磷酸化是蛋白质最重要的翻译后修饰之一，在蛋白质激酶的催化下，腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的磷酸基团可以转移到蛋白质的丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基上，调控蛋白质的生物活性。由图7可知，LPD06283蛋白共有22个磷酸化位点得分大于0.5，包括9个Ser位点、10个Thr位点、3个Tyr位点，但Thr-65、Thr-151、Thr-223位点的得分接近0.5，表明这3个位点被磷酸化修饰的置信度较低，LPD06283蛋白潜在的磷酸化位点为19个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.017.F007图7LPD06283蛋白的磷酸化位点分析结果2.7LPD06283蛋白的相互作用蛋白质分析（见图8）采用STRING数据库分析与LPD06283蛋白相互作用的蛋白质，发现浑浊红球菌的肝素结合血凝素蛋白（HBHA），又名主要脂滴蛋白TadA（MLDP TadA），与LPD06283蛋白的氨基酸序列一致度为100%，因此在PD630菌株中，LPD06283蛋白可能是MLDP TadA蛋白（编号：EP51_32375）。蛋白质间的互作网络图显示与LPD06283蛋白相互作用紧密的蛋白质的交互值为10。LPD06283蛋白的相互作用蛋白包括异源响应元件（XRE）家族DNA结合蛋白、膜蛋白、糖蛋白和未鉴定的蛋白和外膜蛋白组装因子B（BamB）等，相互作用蛋白质的具体信息及得分（可靠性）见表4。由图8和表4可知，XRE家族DNA结合蛋白与LPD06283蛋白的相互作用最强。与LPD06283亲缘关系最近的MLDS蛋白已被验证可以结合DNA，从而在营养和基因毒性压力下减少DNA损伤、提高细菌存活率[16]。因此，LPD06283蛋白可能具有结合和保护DNA的功能。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.017.T004表4与LPD06283蛋白相互作用密切的蛋白质蛋白质编号蛋白质描述综合得分/分EP51_32370XRE家族DNA结合蛋白0.900EP51_32380膜蛋白0.766EP51_11385未鉴定的蛋白质0.757EP51_06670膜蛋白0.754EP51_17635未鉴定的蛋白质0.754EP51_11395未鉴定的蛋白质0.748EP51_23470糖蛋白0.742EP51_04420膜蛋白0.741EP51_06645未鉴定的蛋白质0.733EP51_08230外膜蛋白组装因子BamB0.73010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.017.F008图8LPD06283蛋白的相互作用蛋白质网络3讨论浑浊红球菌PD630在1995年从土壤中分离得到，可以将碳源转化为脂质并储存在LD中[11-12]，积累的油脂可以作为生物柴油[17-18]和食品油脂[19]。目前，浑浊红球菌PD630的基因组、转录组和LD蛋白质组分析均已完成，共发现177个可能参与脂质代谢和LD动态变化的蛋白质，其中一个LD结构蛋白LDP06283已被验证可以调控LD形态[15,20]。因此，LDP06283蛋白可能是微生物油脂开发的重要靶标。LPD06283蛋白含276个氨基酸，相对分子质量较小，这可能是为了适应原核生物较小的LD直径（220~690 nm）[21]。LD蛋白直接定位于LD的模式是疏水区域和双亲性α螺旋[22]，虽然LPD06283蛋白是一种稳定酸性亲水蛋白，但其N端第14~31位氨基酸形成一个双亲性α螺旋，且疏水面占比较高，表明这段序列可能帮助LPD06283蛋白定位于LD表面。LD出现在进化的早期，广泛存在于细菌、真菌、植物和动物细胞中[23]，浑浊红球菌LPD06283蛋白与猪PLIN2蛋白的理化性质产生较大差异，表明在从细菌到哺乳动物的进化中，LD蛋白的生物活性发生较大改变。在进化上，浑浊红球菌LPD06283蛋白与红球菌MLDS蛋白亲缘关系最近，与牛分枝杆菌BCG1169c蛋白亲缘关系也较近，而与其他物种的LD蛋白亲缘关系较远。LD蛋白在同一或相近物种中亲缘关系较近，表明虽然在进化中LD蛋白的功能发生改变，但在同一或相近物种中其功能是保守的。LD是许多细菌菌株中发现的唯一膜性细胞器，因此LD蛋白除参与脂质储存与代谢外，还可能结合DNA[15-16]。细胞进化出细胞核和其他细胞器后，LD蛋白可能参与LD和其他细胞器的相互作用，如内质网[24-26]、线粒体[27-29]、溶酶体/液泡[30-32]等。LPD06283蛋白不含信号肽和跨膜区，表明其不是内在膜蛋白；N端嵌入膜内的区域提示，LPD06283蛋白可能主要以N端双亲性α螺旋镶嵌在LD单层磷脂的脂肪酸链组成的疏水区内，为外在膜蛋白。蛋白质结构分析结果表明，LPD06283蛋白主要由α螺旋构成，包含Apolipoprotein结构域，表明LPD06283蛋白属于Apolipoprotein样蛋白质[33]，可能是参与脂质储存和代谢的LD结构蛋白。蛋白质磷酸化是调节蛋白质活性和定位的重要机制，哺乳动物的LD结构蛋白如PLIN2经实验验证存在磷酸化位点[34]。LPD06283蛋白共有19个潜在磷酸化位点，后续可通过试验进一步验证该结果。蛋白相互作用结果表明，LPD06283蛋白可能是MLDP TadA蛋白，与XRE家族DNA结合蛋白的相互作用最强。XRE家族DNA结合蛋白含有DUF397结构域，在细菌中大量存在，可以调控细胞的形态发育和抗生素合成[35-36]。浑浊红球菌LPD06283蛋白的作用机制可能与红球菌MLDS蛋白类似，可以结合基因组DNA，其表达受到XRE家族DNA结合蛋白的调控。4结论浑浊红球菌LPD06283蛋白可能是一种定位于LD，受激酶调控的DNA结合蛋白，参与调控脂质的储存和代谢。