豆粕是大豆经制油加工后的残渣，由于其优良的营养特性广泛应用于畜禽饲料生产[1-2]。但豆粕中含有多种抗营养因子，如胰蛋白酶抑制剂等[3]，影响其他营养物质的消化吸收，对畜禽的生长发育造成不利影响[4]。微生物发酵豆粕会产生多糖、多肽和游离氨基酸等营养物质，有效降低豆粕中抗营养因子含量，提高豆粕消化率和适口性[5-6]。研究表明，发酵豆粕中植酸酶和大豆凝血素降解率可达100.00%，胰蛋白酶抑制剂降解率能够达到84.44%[7]。杨慧等[8]研究发现，经枯草芽孢杆菌发酵12 h，发酵豆粕中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的抗原性分别降低20.62%和50.12%。陈美松等[9]利用发酵豆粕代替鱼粉饲喂断奶仔猪，结果表明，发酵豆粕具有抑制大肠杆菌、促进乳酸菌生长的作用，进而提高断奶仔猪的生长性能。目前，关于优化微生物发酵豆粕工艺参数的研究较多[10-12]。本试验研究不同因素对微生物发酵豆粕中粗蛋白含量的影响，优化发酵工艺参数，比较最优工艺条件下，发酵前后豆粕中各营养物质的含量，为提升发酵豆粕品质和利用效率提供参考。1材料与方法1.1试验材料与试剂1.1.1试验材料豆粕购自山西粮油集团，为普通豆油生产加工后的废渣，回收干燥后所得。乳酸菌由浙江惠之品生物科技有限公司提供，活菌数≥2.0×1010个/g。麦麸和玉米粉均购自学校附近农贸市场。试验所有化学药品均购自国药集团化学试剂有限公司（分析纯）。大豆抗营养因子快速检测试剂盒（ELISA）购自深圳瑞清生物信息科技有限公司。1.1.2试验仪器RM-200恒温振荡培养箱购自青岛瑞明仪器设备有限公司，DC0506恒温水浴锅购自江苏天翎仪器有限公司，YXQ-LB-75SⅡ高压灭菌锅购自三莉科技有限公司，HC-1000Y粉碎机购自永康市天祺盛世工贸有限公司，UV-1700PC紫外分光光度计购自上海美析仪器有限公司，K9860凯氏定氮仪购自上海五相仪器仪表有限公司。1.2试验设计及检测指标1.2.1乳酸菌发酵豆粕工艺将豆粕置于65 ℃恒温烘箱中烘干约12 h取出，粉碎，过40目筛，封口袋分装。向处理好的豆粕原料中添加1.5%乳酸菌粉（质量分数计），按液料比0.6 L/kg加入无菌蒸馏水，充分搅拌均匀，装入发酵桶。每桶平均装入约20 kg底物，于28 ℃下发酵72 h，发酵结束，开袋取样，将发酵产物置于65 ℃烘箱中烘干，粉碎，过筛，用于检测粗蛋白含量。1.2.2单因素试验设计以1.2.1参数为初始发酵条件，依次改变发酵温度（24、26、28、30、32 ℃）、乳酸菌粉接种量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、发酵时间（12、24、48、72、96 h）、液料比（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 L/kg），考察4个因素对发酵豆粕中粗蛋白含量的影响，每个试验处理分别设3个重复，粗蛋白含量取均值。1.2.3正交试验设计以1.2.2中单因素试验结果为依据，对各因素最佳取值范围进行分析，筛选。采用L9（34）正交试验优化发酵豆粕工艺参数。正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.020.T001表1正交试验因素水平设计水平发酵温度/℃乳酸菌粉接种量/%发酵时间/h液料比/(L/kg)1281.0240.62301.5480.83322.0721.01.2.4豆粕中营养成分含量在最优发酵工艺参数组合条件下，对豆粕进行发酵，比较发酵前后豆粕中各营养物质含量的变化，考察在最优工艺条件下，乳酸菌发酵对豆粕营养价值的影响。参考《饲料中粗蛋白的测定》（GB/T 6432—2018）采用凯氏定氮法测定粗蛋白含量。参考胡永娜等[13]的测定方法，采用三氯乙酸沉淀法测定真蛋白含量。参考张丽英[14]的测定方法，采用烘干重量法测定干物质含量，高温灼烧法测定粗灰分含量。参考AOAC[15]采用尼龙袋法结合纤维分析仪测定中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量。参照朱燕等[16]的方法采用茚三酮显色法测定游离氨基酸含量。采用瑞清生物ELISA试剂盒（酶联免疫法）测定胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量。采用便携式pH检测仪测定pH值，对样品中心连续检测3次，取平均值。1.3数据统计与分析采用Excel 2021软件对所有数据进行清理和汇总，SPSS 22.0软件进行统计分析，对正交试验结果进行极差分析和方差分析，对发酵前后豆粕中各营养成分含量差异进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1发酵温度对发酵豆粕中粗蛋白含量的影响（见图1）由图1可知，随着发酵温度升高，发酵豆粕中粗蛋白含量呈先升高、后下降的趋势。发酵温度达到30 ℃时，发酵豆粕的粗蛋白含量达到最大，为46.67%。因此，在后续正交试验中将发酵温度的因素水平分别设为28、30、32 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.020.F001图1发酵温度对发酵豆粕中粗蛋白含量的影响2.1.2乳酸菌粉接种量对发酵豆粕中粗蛋白含量的影响（见图2）由图2可知，随着乳酸菌粉接种量提高，发酵后豆粕中粗蛋白含量呈出先升高、后下降的趋势。当乳酸菌菌粉接种量达到1.5%时，发酵豆粕中粗蛋白含量达到最大，为46.43%。因此，在后续正交试验中将乳酸菌粉接种量的因素水平分别设为1.0%、1.5%、2.0%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.020.F002图2乳酸菌菌粉接种量对发酵豆粕中粗蛋白含量的影响2.1.3发酵时间对发酵豆粕中粗蛋白含量的影响（见图3）由图3可知，随着发酵时间延长，发酵后豆粕中粗蛋白含量呈先升高、后下降的趋势。当发酵时间达48 h时，发酵豆粕中粗蛋白含量达到最高值，为47.16%。因此，在后续正交试验中将发酵时间的因素水平分别设为24、48、72 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.020.F003图3发酵时间对发酵豆粕中粗蛋白含量的影响2.1.4液料比对发酵豆粕中粗蛋白含量的影响（见图4）由图4可知，随着发酵料中水分含量的升高，乳酸菌发酵后豆粕中粗蛋白含量呈先升高、后平稳的趋势。当液料比为0.8 L/kg时，发酵豆粕中粗蛋白含量最高，为47.13%，之后粗蛋白含量呈下降趋势。因此，在后续正交试验中将液料比水平分别设为0.6、0.8、1.0 L/kg。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.020.F004图4液料比对发酵豆粕中粗蛋白含量的影响2.2正交试验极差、方差分析结果（见表2、表3）由表2可知，根据R值判断，各因素对粗蛋白产量影响的重要性依次为：发酵时间乳酸菌粉接种量发酵温度液料比。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.020.T002表2正交试验极差分析结果项目发酵温度/℃菌粉接种量/%发酵时间/h液料比/(L/kg)粗蛋白含量/%平行1平行2均值1111144.2644.6844.472123247.2846.9847.133132343.1943.2243.204213345.5944.9345.265222144.8444.7844.816231243.8843.6843.787312245.3745.6945.538321345.0545.1745.119333146.2846.6246.45K1134.80135.26133.36135.73K2133.85137.05133.54136.44K3137.09133.43138.84133.57k144.9345.0944.4545.24k244.6245.6844.5145.48k345.7044.4846.2844.52R1.081.211.820.96由表3可知，发酵温度、乳酸菌接种量、发酵时间和液料比对乳酸菌发酵后豆粕中粗蛋白含量均具有极显著影响（P0.01）。结合极差分析和方差分析结果，选择各因素中k值最大的水平为最优参数，可得最优工艺参数为发酵温度32 ℃（k3）、乳酸菌粉接种量1.5%（k2）、发酵时间72 h（k3）和液料比0.8 L/kg（k2）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.020.T003表3方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型36 583.733136 583.733665 307.9860.01发酵温度3.69421.84733.590.01乳酸菌粉接种量4.37122.18639.750.01发酵时间12.88826.444117.1920.01液料比2.97121.48627.0190.01误差0.49590.055注：R²=0.980；F0.05（2，9）=4.26，F0.01（2，9）=8.02。2.3最优工艺条件下发酵前后豆粕中营养水平测定结果（见表4）由表4可知，在最优工艺发酵条件下，发酵后豆粕中粗蛋白、真蛋白、干物质含量显著高于发酵前（P0.05），pH值显著低于发酵前（P0.05）。发酵后豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量显著低于发酵前（P0.05），降解率达97.32%；大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量分别降低了37.08%和27.79%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.020.T004表4发酵前后豆粕中各营养物质含量（干物质基础）项目豆粕发酵豆粕粗蛋白/%43.29±0.08b49.64±0.09a真蛋白/%39.29±0.32b43.67±0.26a干物质/%89.46±0.14b93.38±0.19a粗灰分/%6.43±0.046.64±0.06中性洗涤纤维/%13.56±0.4313.11±0.35酸性洗涤纤维/%10.25±0.249.97±0.19游离氨基酸/%3.37±0.283.54±0.30胰蛋白酶抑制因子/(mg/g)21.29±0.06a0.57±0.02b大豆球蛋白/(mg/g)138.69±1.48a87.26±0.98bβ-伴大豆球蛋白/(mg/g)119.42±1.20a86.23±0.72bpH值6.48±0.01a6.22±0.02b注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。3讨论豆粕中粗蛋白质含量是衡量豆粕商品价值的常用重要指标[12]。普通豆粕经微生物处理后，由于微生物大量繁殖，可将各种非蛋白氮有效的分解和利用，从而转化为营养价值较高的菌体蛋白，进一步提高发酵豆粕中粗蛋白含量[17]。本研究发现，在最优工艺条件下，发酵后豆粕中粗蛋白和真蛋白的含量分别为49.64%和43.67%，明显高于发酵前，粗蛋白含量提升与胡瑞等[12]研究结论一致，真蛋白质含量呈上升趋势与陈京华[18]的研究结果一致。刘稳结等[19]利用多菌种混合发酵豆粕的研究表明，发酵后豆粕真蛋白含量有升高的趋势。可能是由于微生物在繁殖过程中能够将真蛋白吸收分解为游离氨基酸和氨氮等物质，并将游离氨基酸和氨氮等物质合成菌体蛋白，微生物对干物质也有消耗，从而使真蛋白质的含量表现出不稳定的变化趋势。本研究发现，影响发酵豆粕中粗蛋白含量因素排序为：发酵时间乳酸菌粉接种量发酵温度液料比，最优工艺参数为发酵温度32 ℃、乳酸菌粉接种量1.5%、发酵时间72 h和液料比0.8 L/kg，与刘海燕[20]和张佳斌等[21]的研究结果部分一致。本研究中，发酵时间、发酵温度、乳酸菌粉接种量和液料比对发酵后豆粕中粗蛋白含量均具有极显著影响，表明在利用微生物发酵豆粕的过程中，发酵时间、发酵环境温度、底物含水量和接种微生物数量（或种类）等对发酵豆粕中最终粗蛋白产量均具有影响。底物含水量也是影响生产的重要指标之一[8]，随着发酵进行，微生物不断分解底物中的结构支撑物质（如粗纤维和碳水化合物等），造成底物黏连，而黏连的底物又包裹较多的水分并结成团，发酵产物中的水分含量会增加烘干成本。本研究发现，最佳液料比为0.8 L/kg，在实际生产中建议结合具体情况选择合适的液料比以降低后续烘干成本。利用乳酸菌对豆粕进行发酵可提高其营养物质含量，降低豆粕抗营养因子的含量[3]。本研究发现，发酵后豆粕中各抗营养因子含量均显著降低，胰蛋白酶抑制因子降解率达到97.32%，与李杰等[22]的研究结果一致。4结论本研究表明，利用乳酸菌对豆粕进行发酵的过程中，影响发酵后豆粕中粗蛋白含量因素的排序为发酵时间乳酸菌粉接种量发酵温度液料比，发酵最优工艺参数为发酵温度32 ℃、乳酸菌粉接种量1.5%、发酵时间72 h和液料比0.8 L/kg。在此工艺条件下，发酵后豆粕中粗蛋白含量达49.64%。与发酵前相比，发酵豆粕中粗蛋白、真蛋白和干物质含量显著提高，抗营养因子含量显著降低。