贝莱斯芽孢杆菌是一种有益微生物[1],早期相关报道很少,自2019年起才得到重视并加以研究。研究表明,贝莱斯芽孢杆菌基因组高度安全[2-4]。贝莱斯芽孢杆菌不仅广泛分布于土壤、海水及沉积物中,还存在于植物根茎叶和动物肠道中[1-2]。贝莱斯芽孢杆菌可有效促进植物的生长发育和增强植物对周围环境的耐受性;改善动物肠道中微生物群落,增强宿主的免疫系统以及抵御各种致病菌的抗性,广泛应用于生物防治、水产养殖、工业合成等领域。贝莱斯芽孢杆菌具有多种酶活性,主要有纤维素酶、淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶等[5],具有成为工业化产酶菌株的潜力。贝莱斯芽孢杆菌具有多种参与脂肽、细菌素、挥发性有机化合物(VOCs)合成的基因簇[6],这些物质具有高效的抗菌活性[7],在抗肿瘤[8]、抗病毒[9]等方面也有相关研究。贝莱斯芽孢杆菌的多酶特性和抗菌特性,决定了其在养殖业中具有潜在的研究价值。贝莱斯芽孢杆菌与饲料结合应用可增加饲料的利用率,增强畜禽机体免疫功能,提高胃肠道中益生菌丰度,减少抗生素的使用,还可实现对养殖场水体的净化。因此,开展贝莱斯芽孢杆菌在养殖业中的应用研究,对推进安全高效、可持续发展的理念具有重要意义。1贝莱斯芽孢杆菌的菌株特性1.1贝莱斯芽孢杆菌的基本特性贝莱斯芽孢杆菌是一类革兰氏阳性菌,于2005年首次报道命名[10],易分离培养、生物安全性高、抗逆性强,具有耐高温、耐盐的特性[11],可利用多种常见碳氮源,在30~37 ℃、pH值5~7、0~10% NaCl条件下生长较快[12]。贝莱斯芽孢杆菌的菌落不透明,常为白色、灰白色、淡黄色;菌落通常较大、呈圆形或椭圆形、表面不规则、粗糙、中间凹陷、呈褶皱状[13-14]。贝莱斯芽孢杆菌的菌落形态及革兰氏染色结果见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.029.F001图1贝莱斯芽孢杆菌的菌落形态及革兰氏染色结果生理生化结果显示[14-15],贝莱斯芽孢杆菌能够发酵D-甘露醇、蔗糖、七叶苷、D-木糖、L-阿拉伯糖、棉籽糖、山梨醇、肌醇、核糖醇、葡萄糖等;V-P试验、硝酸盐还原、淀粉水解、尿素酶、氧化酶、明胶液化等试验为阳性,可在7% NaCl、pH值5.7的条件下生长。1.2贝莱斯芽孢杆菌的酶特性(见表1)贝莱斯芽孢杆菌是一种新型具有应用前景的产酶菌种,产量大、种类多,可表现多种酶活性,是一种性状优良、产酶丰富的菌种。Zeng等[5]研究发现,贝莱斯芽孢杆菌K8具有多种酶活性,如纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、呋喃果糖苷酶、羧甲基纤维素酶、滤纸酶等,选用啤酒糟作为发酵底物可促进羧甲基纤维素酶和滤纸酶分泌,超声辅助发酵可提高蛋白酶的产量。Li等[16]研究表明,低强度的超声辅助贝莱斯芽孢杆菌发酵可显著提高蛋白酶的产量。贝莱斯芽孢杆菌可产淀粉酶,Bhatt等[17]最先从贝莱斯芽孢杆菌KB 2216的发酵液中分离得到一种寡聚α-淀粉酶Amy3,是一个195 kDa的三聚体大分子,具有3个亚基,在55 ℃和pH值5.5 时选出最高酶活性,Ag2+、Hg2+和 Cd2+可以抑制其活性。单宁酶是一种由各类微生物产生的生物催化剂,可催化单宁的生物转化,广泛应用于饲料、食品工业[18]。单宁酶应用于真菌类微生物的研究较多,关于细菌的研究较少。Lekshmi等[19]利用贝莱斯芽孢杆菌对多种废弃果皮发酵产单宁酶,以石榴皮为最适底物进行固态发酵,最高酶活可达13.2 U/g,且发酵时间、水分、单宁酸浓度是影响单宁酶产量的重要因素。Bafana[20]研究表明,贝莱斯芽孢杆菌具有AzoR2偶氮还原酶活性,可促进偶氮染料的无害化降解。AzoR2偶氮还原酶与枯草芽孢杆菌中分离得到的YhdA偶氮还原酶在氨基酸组成、物理化学性质方面差异较大,表明偶氮还原酶在系统发育的关系相距遥远。木聚糖酶广泛应用于酿造、造纸、饲料工业,可分解原料中的细胞壁及β-葡聚糖,促进有效物质释放和原料利用。Ghosh等[21]从贝莱斯芽孢杆菌AG20的发酵液中分离得到一种耐热的内切木聚糖酶,能够酶切β-(1→4)木聚糖,纯化的酶活达21 U/mL,可用作新型高温催化剂。该内切木聚糖酶酶解甘蔗渣得到的低聚木糖可在胃肠道中保持较高的稳定性,促进益生菌双歧杆菌的生长,显著抑制癌细胞HT-29和Caco-2增殖。L-天冬酰胺酶在白血病和恶性肿瘤的治疗中具有广泛应用。Mostafa等[22]从海洋沉积物中分离得到一株无谷氨酰胺酶活性的贝莱斯芽孢杆菌,表现出较高的L-天冬酰胺酶活性,在医学上无副作用,对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231具有很强的抑制效果。纤溶酶可分解纤维蛋白,阻碍纤维蛋白在血管中沉积,从而降低血栓的发生。Lu等[23]从贝莱斯芽孢杆菌SN-14发酵液中分离纯化得到纤溶酶,分子量约28 kDa,通过Fe2+、mPEG5000和胃蛋白酶对纤溶酶化学修饰可使其酶活力提高7.3倍,增强其热稳定性和酸碱稳定性,在开发纤溶药物方面具有应用潜力。贝莱斯芽孢杆菌还表现出其他潜在的酶活性,如羧酸酯酶、磷酸-β-半乳糖苷酶活性、漆酶等。Huang等[24]通过生物信息学分析从贝莱斯芽孢杆菌H47的基因组中筛选得到一种新型羧酸酯酶(BaCeEs04)的基因,并在大肠杆菌BL21中成功克隆表达,该酶在各种有机溶剂、洗涤剂和金属离子中表现出较强的稳定性。Liu等[25]从贝莱斯芽孢杆菌中克隆磷酸-β-半乳糖苷酶的基因BsGal1332,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,该酶分子量为113 kDa,对乳糖和2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷表现出严格的底物特异性,在40 ℃低温下表现出较强稳定性,在Ca2+溶液中性质稳定,可作为一种新型生物催化剂水解牛奶中的乳糖。Li等[26]将源自贝莱斯芽孢杆菌TCCC 111904的新型漆酶基因在大肠杆菌中成功表达,该漆酶在pH值3~7、温度70~90 ℃、高浓度NaCl条件下表现出较强的稳定性,对各种类型染料具有显著的脱色作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.029.T001表1贝莱斯芽孢杆菌分泌的酶种类菌株名称来源酶的种类文献来源K8中国佛山酿酒厂纤维素酶、蛋白酶、木聚糖酶等Zeng等[5]KB2216土壤α-淀粉酶Bhatt等[17]H47蜂蜜羧酸酯酶Huang等[24]CICC 23571中国工业培养物保藏中心蛋白酶Li等[16]TA3印度泰米尔纳德邦盐田单宁酶Lekshmi等[19]续表1 贝莱斯芽孢杆菌分泌的酶种类10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.029.T002菌株名称来源酶的种类文献来源AB—偶氮还原酶Bafana[20]AG20—木聚糖酶Ghosh等[21]A4实验室菌库纤维素酶Liu等[27]KB-9沙特阿拉伯红海沉积物天冬酰胺酶Mostafa等[22]SN-14发酵食品纤维蛋白溶解酶Lu等[23]SW-5鱼露醪磷酸-β-半乳糖苷酶Liu等[25]TCCC中国海南森林土壤漆酶Li等[26]TSB1印度恰蒂斯加尔邦木材区土壤锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、漆酶Verma等[28]TAP5自制发酵食品蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等Roslan等[29]注:“—”表示未知。1.3贝莱斯芽孢杆菌的抗菌特性贝莱斯芽孢杆菌通过破坏菌丝形状结构抑制细菌生长,对多种致病菌表现出显著抑制作用,贝莱斯芽孢杆菌抗菌的种类见表2,其作用机制见图2。贝莱斯芽孢杆菌的基因组决定了其广谱抗菌性,全基因组测序发现其具有多种参与聚酮化合物、脂肽、细菌素合成的基因簇,含有一系列促进植物生长、增强植物体免疫活性的基因[6]。贝莱斯芽孢杆菌的基因组显示其具备srfAA、ituA、fenA、dhbA、bmyA、beaS、dfnA等多种肽聚糖、聚酮类化合物和抗菌蛋白生物合成的基因[30],可有效抑制嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、弗氏柠檬酸杆菌等水产致病菌。贝莱斯芽孢杆菌在生长过程中会散发一些具有抗菌活性的挥发性有机化合物(VOCs),如2-十一烷酮、2-庚酮、1-丁醇、丙酮、苯甲醛、二乙酰、壬烷或吡嗪等,苯甲醛和二乙酰的抗菌效果最好,可有效治疗灰霉病、褐腐病、蓝腐病[7]。UPLS质谱表明,贝莱斯芽孢杆菌抗菌特性与其合成的脂肽同系物有关,序列FA-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu和C12-C16,Asn-Tyr-Asn-Gln-Pro-Asn-Ser-FA和C14-C17,Ile-Tyr-Gln-Pro-Val-Glu-Thr-Tyr-Orn和C15-C17组成的脂肽是影响抗菌活性的关键脂肽[31]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.029.T003表2贝莱斯芽孢杆菌抗菌的种类抗菌种类菌株名称文献来源革兰氏阳性菌炭疽杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、肠道链球菌、产气荚膜梭菌、粪肠球菌和格氏乳球菌Reyes-Estebanez等[33]、Li等[31]、Soni等[4]、Li等[1]革兰氏阴性菌维氏气单胞菌、类志贺邻单胞菌、副溶血弧菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌、迟缓爱德华氏菌、最小弧菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、豚鼠气单胞菌、霍乱弧菌Li等[30]、Clarke等[32]、Wu等[34]、Wang等[35]、Wang等[36]、Li等[31]、Li等[1]、Zhu等[37]真菌棒曲孢菌、斑点拟盘多毛孢菌、镰刀菌、黑曲霉、黄曲霉、灰霉、念珠菌Reyes-Estebanez等[33]、Li等[31]、Calvo等[7]10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.029.F002图2贝莱斯芽孢杆菌的抗菌活性机制贝莱斯芽孢杆菌基因组包含多种抗菌活性的枯草芽孢杆菌蛋白酶的基因簇,支原体经贝莱斯芽孢杆菌处理前后蛋白质组发生明显变化,参加应激反应的蛋白丰度增加,转录蛋白、核糖体蛋白、生长代谢蛋白丰度减少[32],表明贝莱斯芽孢杆菌可通过诱导致病菌应激基因的过量表达,抑制生长、代谢基因的表达从而实现抗菌效果。2贝莱斯芽孢杆菌在养殖业中的应用研究2.1贝莱斯芽孢杆菌在水生动物养殖中的应用研究贝莱斯芽孢杆菌不含强毒因子或毒素编码基因[4],具有安全性,不会引起水生动物生理异常或死亡[1]。贝莱斯芽孢杆菌具有较好的黏附和聚集特性,可长期附着于动物肠道,并保持73%的存活率,对多种致病菌表现出拮抗作用,增强宿主的免疫系统和提高饲料的利用率[3]。研究发现,嗜水气单胞菌对大西洋鲑鱼的致死率达93%[36],投喂贝莱斯芽孢杆菌后可大幅降低鲑鱼的死亡率,显著提高鲑鱼生长速度、抗氧化能力和饲料的利用率。欧洲海鲈通过膳食补充贝莱斯芽孢杆菌,白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α和环氧合酶-2表达增强[38],对鳗弧菌的抵抗性增强。贝莱斯芽孢杆菌进入肠道后,会上调宿主细胞内MAPK和NF-κB的信号通路[39],激活先天性免疫系统和调节肠道微生物种群提高免疫增强效应。如石斑鱼食用含贝莱斯芽孢杆菌的饵料后,体内溶菌酶、免疫球蛋白(IgM)等免疫蛋白基因的表达显著提高,石斑鱼在哈氏弧菌侵染下的死亡率大幅降低[1]。草鱼食用含贝莱斯芽孢杆菌的饵料后,不仅诱导体内免疫酶AKP和SOD的表达,还显著提高免疫基因IgM、IgD、TNF-α、MHCI的表达,对嗜水气单胞菌、维罗纳气单胞菌、副溶血弧菌等鱼类病原菌表现出很强的抵抗性[34]。贝莱斯芽孢杆菌存在大量抗菌基因簇,如杆菌素、大环内酯、杆菌溶素、丰原素等[40],通过释放这些抗菌活性物质实现对致病菌的抑制。贝莱斯芽孢杆菌基因组中已被鉴定出具有7个提高鱼类对植物性饲料消化率的淀粉酶编码基因[35]以及合成6种维生素和11种氨基酸的推定基因[2]。有研究发现,贝莱斯芽孢杆菌还具备杀螺活性[41],通过侵染钉螺致其糖原代谢紊乱而达到杀螺的效果,这一发现可为解决福寿螺外来物种入侵问题提供新策略。也有研究表明,贝莱斯芽孢杆菌还具有抗病毒活性,可抑制鲤鱼病毒糖蛋白和核蛋白基因表达,同时促进抗病毒免疫基因ifnφ、IFNφ2β、TNF-α和MDA5的表达[9],最高可抑制95%鲤鱼病毒活性,贝莱斯芽孢杆菌抗病毒活性的发现为解决鱼类病毒提供一种新途径。2.2贝莱斯芽孢杆菌在陆生动物养殖中的应用研究贝莱斯芽孢杆菌存在多种参加酸反应和胆汁反应的基因[4],在动物胃肠道中具有很强的耐受性。叶淼[42]研究发现,鸡蛋采食贝莱斯芽孢杆菌后,体内孕酮和胃动素含量显著增加,平均日产蛋率和日摄食量均增加,但鸡蛋重量、蛋壳强度、蛋壳重量略有下降。猪食用含贝莱斯芽孢杆菌的饲料后,平均日采食量和日增重均有提高,料重比降低[43]。贝莱斯芽孢杆菌作为一种益生菌[44],对陆生动物胃肠道中微生物群落改善具有正向作用。小鼠食用含贝莱斯芽孢杆菌的饲料后,肠道中乳杆菌、乳球菌等益生菌的丰度提高,不动杆菌、盲肠螺杆菌等病原菌丰度显著降低[45];猪粪便菌群中毛螺菌科和瘤胃球菌属的丰度增加,链球菌致病菌丰度降低[43]。2.3贝莱斯芽孢杆菌在养殖场废水处理的应用研究在规模化养殖过程中往往伴随着大量的养殖废水产生,微生物制剂的投入使用可有效改善水质[46],而贝莱斯芽孢杆菌也可应用于养殖场废水净化,缓解养殖废水对家禽、水生生物的危害。贝莱斯芽孢杆菌伴随饵料投入养殖水体中后,可改善水体中菌群结构[47],显著降低水体中总磷、总氮、硝酸盐[48]、氨氮、亚硝酸盐的含量[37]。3结论贝莱斯孢杆菌是一种有益微生物,生物安全性高,具有产酶和抗菌特性。贝莱斯芽孢杆菌在养殖业具有很大的开发潜力,但目前其优势菌种的选育尚未明确,未被商业化生产应用,实际价值未得到推广,今后应开展关于微生物应用的研究。此外,贝莱斯芽孢杆菌的研究仍不全面,研究方向单一、缺乏多样性,主要围绕产酶和抗菌特性展开研究,贝莱斯芽孢杆菌的其他生物学特性及作用机制尚未明确,应从多方面挖掘贝莱斯芽孢杆菌的潜在特性,补充现阶段贝莱斯芽孢杆菌研究内容的空缺。
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