冷季是青藏高原地区放牧畜种最为艰难的时期，草畜供求矛盾突出或自然灾害发生时，会严重影响草畜生长发育和繁衍[1-3]。为了减少牦牛冬季的体重损失，常使用粗饲料（如干饲料、干燕麦、大麦秸秆）和精饲料（如玉米、菜籽饼、麦麸、舔砖等）对放牧牦牛进行补饲[4-5]。目前，根据牦牛在冷季胃肠道的内环境及微生物区系的变化进行科学补饲的研究较少。本试验对1.5岁与3.5岁放牧牦牛进行冷暖季瘤胃微生物区系比较分析，为放牧牦牛的科学补饲及季节性畜草不平衡等问题提供参考。1材料与方法1.1试验地点试验于青海省玉树州歇武镇的牧场进行，平均海拔达4 500 m，年平均温度为-1.6 °C。1.2试验设计采用随机区组设计选取健康、体重相近的1.5岁公牦牛5头，3.5岁的公牦牛5头，冷暖季节不同年龄放牧牦牛的体重见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.T001表1冷暖季节不同年龄放牧牦牛的体重年龄暖季冷季1.5岁119.40±5.82117.70±9.283.5岁189.40±13.69176.00±16.43kg于2021年9月30日进行暖季试验样品采集，于2021年12月30日进行冷季试验样品采集。天然牧草样品根据牦牛采食情况采集，牧草营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.T002表2牧草营养水平（干物质基础）项目牧草暖季冷季粗灰分5.325.45粗蛋白11.282.81粗脂肪3.662.58中性洗涤纤维42.7048.60酸性洗涤纤维31.7340.64钙0.310.32磷0.170.07钙/磷1.965.7%牦牛禁食、禁水8 h，采集瘤胃液。根据牦牛年龄和采样时间分为BO组（暖季采集1.5岁公牦牛瘤胃液）、BT组（冷季采集1.5岁公牦牛瘤胃液）、DO组（暖季采集3.5岁公牦牛瘤胃液）和DT组（冷季采集3.5岁公牦牛瘤胃液）。每头牦牛使用5 mL无菌冻存管采集两管瘤胃液并放入液氮中保存，转移至-80 ℃冷藏，提取DNA。1.3瘤胃微生物区系的测定将瘤胃液样品送至北京诺和致源生物技术公司检测。样品瘤胃液内的微生物需要在Illumina MiSeq平台上进行测序，文库构建使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit试剂盒。检测流程为DNA提取与检测，PCR扩增，产物纯化，文库制备及库检，Novaseq检测。1.4数据统计与分析数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1DNA提取与PCR扩增结果（见图1、图2）由图1可知，提取的DNA纯度和浓度均能满足DNA质量和数量的要求，在此基础上可以进行后续检测；由图2可知，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测后，可以选择条带在400~450 bp之间的样品进行下一步试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.F001图1冷暖季节放牧牦牛瘤胃微生物总DNA凝胶电泳结果注：S为10 000 bp的marker，M-1、M-2均为5 000 bp的marker，11~15为BO组样品，16~20为BT组样品，26~30为DO组样品，31~35为DT组样品。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.F002图2瘤胃微生物总DNA凝胶电泳PCR扩增结果注：6~10为BO组样品，11~15为BT组样品，21~25为DO组样品，26~30为DT组样品。2.2冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌操作分类单元（OTU）与Alpha多样性分析结果（见表3、图3）由表3可知，经20个样本测定后得知，4组在3%的距离上获得OTU数目一共为3 236个，平均每个样本的OTU数为2 110个，1.5岁牦牛和3.5岁牦牛的瘤胃微生物在冷季的OTU个数显著高于暖季（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.T003表3冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌的OTU数目和Alpha多样性分析项目BO组BT组P值DO组DT组P值操作分类单元2 091.40±81.50b2 294.20±152.42a0.0301 876.40±175.73b2 178.00±55.94a0.006测序深度指数0.98±0.020.98±0.010.1790.99±0.050.98±0.010.573ACE指数2 257.32±125.812 212.34±142.340.6111 957.00±253.602 106.33±44.830.231Chao1指数2 266.65±102.122 191.69±137.080.3561 941.28±279.292 067.77±28.690.343Shannon指数8.87±0.288.76±0.200.4878.51±0.318.55±0.190.837Simpson指数0.99±0.030.99±0.020.2730.99±0.020.99±0.030.359注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。由图3可知，试验样本的覆盖率均为97%以上，表明测序深度可靠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.F003图3冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌稀疏曲线2.3冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌在门水平上的优势菌群分析（见图4、图5）运用鉴定学分析法进行菌门鉴定，共检测出了27个菌门。由图4可知，4组的优势菌门均为拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）。冷季组拟杆菌门的相对丰度明显高于暖季组（P0.05），厚壁菌门相对丰度明显降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.F004图4冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌门水平相对丰度由图5可知，在1.5岁和3.5岁的公牦牛瘤胃中冷季组拟杆菌门（Bacteroidetes）、软壁菌门（Tenericutes）相对丰度明显高于暖季组，冷季组公牦牛瘤胃的厚壁菌门和互养菌门（Synergistetes）等的相对丰度明显低于暖季组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.F005图5冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌门水平聚类热图2.4冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌在属水平的优势菌群分析（见图6、图7）在属水平上，冷暖季公牦牛样品共检测到了229个菌属。由图6可知，BO组和BT组优势菌属分别是未分类的普雷沃氏菌属（unidentified-Prevotellaceae）（5.31%、3.75%）、未分类的瘤胃球菌属（unidentified-Ruminococcaceae）（3.50%、2.80%）、未分类的毛螺菌属（unidentified-Lachnospiraceae）（3.40%、2.38%）。DO组和DT组中最常见的是未分类的普雷沃氏菌属（5.26%、4.08%）、奎因氏菌属（Quinella）（3.99%、0.02%）、甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）（3.09%、0）、未分类的拟杆菌属（unidentified_Bact）（2.86%、3.25%）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.F006图6冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌属水平相对丰度由图7可知，在1.5岁和3.5岁牦牛瘤胃中，产酸糖酵菌属（Saccharofermentans）和Papillibacter等菌属在冷季组中明显高于暖季组，而未分类的普雷沃氏菌属（Oisenella）和欧氏菌属（Enterorhabdus）明显降低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.F007图7冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌属水平热图2.5冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌的聚类差异分析（见图8）瘤胃微生物群落的主坐标分析（PCoA）能够反映本试验中不同处理组公牦牛瘤胃微生物群落的差异。由图8可知，与暖节处理组的公牦牛相比，在冷季的公牦牛瘤胃微生物群发生了较大的变化，冷季组的微生物群落的PCoA结果与暖季组的微生物群落PC1存在明显差异，其中达到了总变异的53.58%，而PC2差异在总变异中也高达14.49%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.F008图8冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌的主坐标分析（PCoA）图2.6冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌的代谢途径和功能预测比较分析（见图9~图12）由图9可知，代谢功能在每个处理组中的相对丰度最高，在组中达到了总阅读量的45%。由图10可知，经过冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌KEGG水平2功能预测几个处理组均集中在属于膜转运（Membrane transport）、碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代谢（Amino acid metabolism）等通路。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.F009图9冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌KEGG水平1功能预测10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.F010图10冷暖季节放牧牦牛瘤胃细菌KEGG水平2功能预测由图11、图12可知，在1.5岁和3.5岁牦牛瘤胃中，冷季组的聚糖生物合成与代谢（Glycan biosynthesis and metabolism）、运输和分解代谢（Transport and catabolism）、酶家族（Enzyme families）和脂质代谢（Lipid metabolism）等基因表达量明显高于暖季，而冷季的翻译功能基因表达量明显低于暖季。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.F011图11使用PICRUSt测定的BO组和TO组的KEGG路径比较10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.001.F012图12使用PICRUSt测定的DO组和DT组的KEGG路径比较3讨论青藏高原夏秋季节短暂，冬季漫长，草盛期较短，冬季较为寒冷，常年积雪，反刍动物牧草比较匮乏[6]。牦牛采用的主要机制是内源性应答，可以调节机体内外环境的改变以及自身的消化代谢等。牦牛会采用内源性应答机制在夏季采食大量牧草，在冬季缺少牧草时为机体提供部分能量；且牦牛夏季的代谢率显著高于冬季，表明牦牛在冬季时机体主动会减少对能量的消耗[7-8]。而牦牛在自然放牧条件下，夏秋两季牦牛的采食量要远高于冬春两季[6]。研究表明，冷季对放牧牦牛的生长发育及营养物质的消化吸收具有明显的抑制作用[9-11]，特别是对牦牛犊牛的生长发育影响极为显著[12-13]。在反刍动物的瘤胃微生物区系中，瘤胃细菌区系发展的基础是纤维裂解菌，其可为反刍动物瘤胃内的其他菌群提供底物的来源[14-16]。瘤胃菌群结构和功能的稳定性，也决定了牧草在瘤胃的消化状况[17-20]。本研究发现，在放牧牦牛瘤胃中纤维裂解相关细菌类群细菌含量所占比例很高。除了纤维裂解功能的纤维杆菌门外，厚壁菌门和螺旋体门也与高纤维草料的降解相关[21]。本试验中，纤维杆菌门、厚壁菌门和螺旋体门在冷季中的相对丰度均低于在暖季。原因可能是冷季天然牧草的质量与数量均不足，导致摄入的纤维减少，故而纤维降解菌的含量降低。在冷暖季节转换时，各牦牛瘤胃菌群应答季节变化时，普雷沃氏菌属、理研菌属、韦荣氏球菌属、琥珀酸弧菌属和毛螺菌属等水解产物降解细菌菌属的相对丰度存在差异。反刍动物瘤胃中的欧氏菌属可能具有益生菌的作用，挥发性脂肪酸的生成与其水解产物降解菌群的活性息息相关，所以欧氏菌属可以为反刍动物提供能量的来源，进而影响机体的生产性能。本试验在功能预测中发现，牦牛运输和分解代谢和脂质代谢等功能在冷季明显高于暖季，但是能量代谢等功能反而低于暖季，表明放牧牦牛在冷季要消耗更多的脂肪维持机体的生长发育，但是能量供应依旧不足。在暖季，放牧牦牛瘤胃水解产物降解菌群在种类数和效应量上均高于冷季，与暖季牧草含有较多的可降解成分相关，从微生物学上解释了冷季放牧牦牛产能效率及体重降低的原因。在反刍动物瘤胃内存在的产甲烷菌作为主要的还原氢清除剂，可以利用营养物质在瘤胃发酵过程中通过一系列反应产生甲烷[22]。在这一系列的反应中，产甲烷菌可以自身从其中获得能量来源，能够为反刍动物瘤胃内的厌氧菌提供适宜的生存环境以及氢清除系统，产生的还原氢可以防止还原性辅因子被再次氧化，从而避免瘤胃中微生物发酵活性被其抑制[23-24]。反刍动物瘤胃内的产甲烷古细菌相较于其他菌群含量较少，约为1%，但是产甲烷古细菌产生的还原当量能够为其他菌群在瘤胃内提供适宜的生存环境，直接影响瘤胃发酵功能，从而间接影响反刍动物的营养；其产生的还原氢清除剂避免了对瘤胃内的微生物发酵活性的抑制效应，从而促进瘤胃内的挥发性脂肪酸的代谢，提高了反刍动物发酵效率[25]。研究表明，甲烷短杆菌属和甲烷微球菌属主要分布在瘤胃固体食糜中[26-27]，还在一些反刍动物的粪便中存在[28]。研究发现，产甲烷古细菌的一些株系同为热原体属的成员[29]，而对于其他寒冷地区，反刍动物体内存在着大量的热源体属，如麝牛粪便样[28]、驯鹿瘤胃样本[30-31]。但本试验并没有检测到广泛分布在反刍动物瘤胃中的甲烷微球菌属和热原体属[32-33]。原因可能是青藏高原在缺氧且寒冷的环境中，牦牛的采食种类较少，且在冷季，以灌木枝叶为主要的食物来源，高纤维的饮食抑制了该菌属的组成以及菌群活性；而牦牛经过漫长的环境适应性，该菌群在瘤胃内存留较少[34]。本试验中，冷季与暖季牦牛瘤胃细菌在属水平上还检测出颤螺菌属。颤螺菌属在牦牛的瘤胃中的比例不高，但其对反刍动物极为重要，可以帮助瘤胃不断地适应外界环境的改变；在瘤胃发酵过程中，植物日粮经历一系列反应导致瘤胃环境改变，这也导致瘤胃细菌区系为了适应环境的变化形成了一种动态平衡[35-37]。本试验中，可以发现涉及上述过程的一些菌群在不同的季节比例会进行调整，而在冷季牧草营养物质的含量如蛋白和脂肪明显低于暖季，粗纤维含量明显高于暖季，表明牦牛瘤胃内的细菌区系会根据牧草营养物质的转变进行一系列调整，从而适应外界环境改变。4结论在暖季，放牧牦牛瘤胃水解产物降解菌群在种类数和效应量上均高于冷季，与暖季牧草含有较多的可降解成分相关，从微生物学上解释了冷季放牧牦牛产能效率及体重降低的原因。运输和分解代谢、脂质代谢等功能在冷季明显高于暖季，但是能量代谢等功能低于暖季，表明放牧牦牛在冷季要消耗更多的脂肪维持机体的生长发育，但是能量供应依旧不足。