家禽肠道健康是养殖的关键，肠道是家禽最大的消化系统和免疫系统，肠道细菌性感染可对家禽生产造成巨大经济损失[1-2]。抗生素在畜禽肠道疾病治疗过程中具有重要作用[3]，但抗生素的滥用问题日益严重，可通过粪便、食物等影响人类健康。研究发现，微生态制剂、酶制剂、抗菌肽、植物提取物及酸化剂等可作为饲用抗生素替代品[4-5]。微生态制剂是由已知的有益微生物组成的制品，其功效与菌种的来源、菌种组成、发酵生产工艺等均密切关系[6]。研究表明，微生态制剂能够调节畜禽肠道微生态平衡，抑制有害菌增殖，增强机体免疫力，提高饲料利用率等，是具有发展应用潜力的饲料添加剂[7-8]。白羽肉鸡在大规模饲养环境下应激因素众多，肠道疾病频发[9]。幼龄时期肉鸡肠道上皮细胞未被正常菌群占据，肠道微生态系统、黏膜免疫未发育成熟，肠道极其脆弱，易受疾病感染[10]。研究表明，益生菌可调节雏鸡肠道菌群，降低腹泻率，提高生长性能。本试验所用解淀粉芽孢杆菌B-4M-6筛选自健康青年鸡，具有广谱抑菌活性，能够产蛋白酶、纤维素酶、有机酸等[11]。本试验在饮水中添加不同水平的解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液，观察其对肉鸡生长性能、肠道菌群、消化酶活性/血清生化、免疫指标的影响，为鸡源性解淀粉芽孢杆菌B-4M-6的临床应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液参考文献[12]，由河北维尔利动物药业集团有限公司研发中心发酵制备。1日龄的AA肉仔鸡购自衡水饶阳某鸡场，试验地点为石家庄鹿泉区某鸡场。试验所用联免疫分析试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司，伊红美蓝培养基、MRS琼脂培养基、XLD培养基均购自北京陆桥技术股份有限公司。40% NaOH溶液、2.0%硼酸溶液、0.1 moL/L盐酸溶液、甲基红-次甲基蓝指示剂参考文献[13]配制。1.2试验设计试验采用单因素完全随机设计，选择240只1日龄AA肉仔鸡，随机分为4组，每组6个重复，每个重复10只鸡。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别在饮水中添加0.1%、0.3%、0.5%的菌含量为1.0×109 CFU/mL的解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液，对照组饮水中不加任何药物。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.008.T001表1基础日粮组成及营养水平项目1~21 d22~42 d原料组成/%玉米59.2563.85豆粕28.2023.20玉米蛋白粉5.756.20豆油2.302.76石粉1.381.25碳酸氢钙1.821.55食盐0.250.25氯化胆碱0.200.16蛋氨酸0.150.08赖氨酸0.220.20预混料0.480.50合计100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)13.47013.630粗蛋白质/%20.67019.060钙/%1.0480.923总磷/%0.6820.619蛋氨酸/%0.5030.417赖氨酸/%1.1461.011苏氨酸/%0.7720.710注：1.每千克预混料为基础日粮提供：VA 1 350万IU、VD3 262.5万IU、VE 4.5万IU、VK3 1.25 g、VB1 0.50 g、VB2 3.75 g、VB12 0.007 5 g、VB6 8.75 g、泛酸钙6.25 g、叶酸0.125 g、FeSO4·7H2O 15.60 g、CuSO4·5H2O 0.75 g、ZnSO4·7H2O 8.78 g、MnSO4·5H2O 3.90 g、KI 8.50 g、CoCl2·6H2O 0.50 g、抗氧化剂0.10 g。2.营养水平为计算值。1.3饲养管理肉鸡采用笼养，每个笼饲养2只，鸡舍通风良好，免疫按照肉鸡正常免疫程序进行。每天8：00和17：00饲喂，自由采食饮水，试验期42 d。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能分别于1、21、42日龄对每个重复肉鸡进行称重，计算生长前期（1~21日龄）、生长后期（22~42日龄）和全期（1~42日龄）的平均日增重。记录养殖全程的采食量和死亡只数，计算阶段肉鸡的平均日采食量、料重比和腹泻率。平均日采食量=总采食量/(试验天数×肉鸡数)(1)平均日增重=(末重-初重)/(试验天数×肉鸡数)(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)死亡率=死亡数/总数×100%(4)1.4.2肠道微生物菌群及消化酶活性试验结束后，每个重复随机选取2只体重接近平均体重的鸡宰杀，在无菌条件下采集盲肠内容物，按照孙波等[14]的方法采用平板涂布法测定盲肠中大肠杆菌、沙门氏菌、双歧杆菌和乳酸菌的数量，菌数使用1 g盲肠内容物所含细菌总数的对数表示（lgCFU/g）。取十二指肠食糜、空肠食糜和胰脏各2 g置于无菌离心管中，-20 ℃冰箱中冷冻贮存。采用试剂盒测定样品中淀粉酶、脂肪酶及胰蛋白酶活性。1.4.3粪便中粗蛋白含量每组随机选取3个重复肉鸡，于试验第1、10、20、30、42 d采集鸡粪100 g，使用无菌袋密封保存标记，-20 ℃冰箱冻存。将粪便在烘箱中60 ℃烘干，直至恒重，粉碎，过40目筛。采用凯氏定氮法[13]检测粪便中粗蛋白的含量。1.4.4血清生化指标及免疫指标分别于试验的第21、42 d，每个重复随机选2只鸡，翅下静脉采血10 mL，离心取血清，-20 ℃保存，送至河北蕴鸿检测公司检测血清总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、尿素氮、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、谷草转氨酶、谷丙转氨酶。采用ELISA试剂盒检测血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel 2020进行初步统计，SPSS 22.0进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对肉鸡生长性能的影响（见表２）由表2可知，与对照组相比，21、42日龄，各试验组肉鸡末重显著提高（P0.05），试验Ⅱ组和Ⅲ组肉鸡的料重比均显著降低（P0.05）；全期试验Ⅱ组和Ⅲ组肉鸡的平均日采食量均显著提高（P0.05），各试验组肉鸡的死亡率分别降低了18.14%、42.10%、46.90%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.008.T002表2解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对肉鸡生长性能的影响项目对照组试验Ⅰ组试验Ⅱ组试验Ⅲ组前期（1~21日龄）1日龄体重/g45.25±0.7046.07±0.7945.08±0.1344.75±0.4221日龄体重/g935.32±3.20d944.11±2.27c967.71±2.95b978.45±2.99a平均日增重/[g/(只·d)]42.38±1.2342.76±0.6943.93±2.3144.46±1.09平均日采食量/[g/(只·d)]53.40±2.3252.17±1.2852.72±4.1152.46±1.86料重比1.26±0.02a1.22±0.01ab1.20±0.02b1.18±0.01b后期（22~42日龄）42日龄体重/g2 454.52±29.51d2 595.61±25.03c2 754.20±37.66b2 886.07±43.53a平均日增重/[g/(只·d)]72.34±1.25d78.64±1.08c85.07±1.65b90.84±1.93a平均日采食量/[g/(只·d)]112.13±2.26c119.54±1.91bc125.05±2.89ab128.99±3.22a料重比1.55±0.02a1.52±0.02a1.47±0.01b1.42±0.02c全期（1~42日龄）平均日增重/[g/(只·d)]57.36±0.69d60.70±0.58c64.50±0.20b67.65±1.03a平均日采食量/[g/(只·d)]82.77±1.29c85.85±1.60bc88.89±3.50ab90.73±2.54a料重比1.44±0.02a1.41±0.02ab1.38±0.02bc1.34±0.02c死亡率/%6.12±0.41a5.01±0.12b3.59±0.31c3.25±0.23c注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4、表6与此同。2.2解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对肉鸡肠道微生物菌群的影响（见表３）由表3可知，与对照组相比，试验Ⅱ组、Ⅲ组肉鸡肠道双歧杆菌数量显著提高了15.03%、16.39%（P0.05）；试验Ⅲ组肉鸡肠道乳酸菌含量显著增加了13.31%（P0.05），沙门氏菌含量显著降低了16.12%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.008.T003表3解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对肉鸡肠道微生物菌群的影响组别双歧杆菌乳酸菌大肠杆菌沙门氏菌对照组7.32±0.19b8.04±0.28b8.72±0.817.01±0.36a试验Ⅰ组7.56±0.21ab8.25±0.33ab8.41±0.396.65±0.52ab试验Ⅱ组8.42±0.74a8.88±0.59ab7.26±0.695.91±0.39ab试验Ⅲ组8.52±0.43a9.11±0.36a7.31±0.415.88±0.40b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表5、表7与此同。lgCFU/g2.3解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对消化酶活性的影响（见表４）由表4可知，与对照组相比，试验Ⅲ组肉鸡胰脏中胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性显著提高了19.83%、41.98%、6.88%（P0.05），试验Ⅲ组肉鸡十二指肠中胰蛋白酶、脂肪酶活性分别提高了6.25%、8.72%（P0.05），试验Ⅱ组、Ⅲ组肉鸡空肠中脂肪酶活性分别提高了5.85%、7.87%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.008.T004表4解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对肉鸡消化酶活性的影响项目消化酶种类对照组试验Ⅰ组试验Ⅱ组试验Ⅲ组胰脏胰蛋白酶/(U/mg)182.12±2.21c198.37±2.20b214.76±5.52a218.23±5.91a脂肪酶/(U/L)27.99±1.11b31.74±2.33b36.51±3.15ab39.74±2.46a淀粉酶/(U/L)2 074.10±26.60c2 100.20±63.20bc2 191.30±37.00ab2 216.80±25.80a十二指肠胰蛋白酶/(U/mg)3 669.22±20.73c3 752.21±30.08b3 866.28±21.15a3 898.69±32.78a脂肪酶/(U/L)139.18±5.34b142.25±3.12ab149.58±2.55a151.32±3.14a淀粉酶/(U/L)13 515.80±321.4013 590.20±123.5013 659.10±183.3013 702.20±212.10空肠胰蛋白酶/(U/mg)1 749.61±51.211 752.36±28.621 766.92±31.421 772.42±21.62脂肪酶/(U/L)87.15±1.68b89.33±2.10ab92.25±3.21a94.01±1.22a淀粉酶/(U/L)16 365.40±351.2016 405.20±236.2016 512.00±251.0016 552.20±154.202.4解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对肉鸡粪便中粗蛋白含量的影响（见表５）由表5可知，与对照组相比，试验第10 d，试验Ⅱ组肉鸡粪便中粗蛋白含量显著降低了7.59%（P0.05）；试验第20 d，试验Ⅱ组肉鸡粪便中粗蛋白含量显著降低了6.37%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.008.T005表5解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对肉鸡粪便中粗蛋白含量的影响组别1 d10 d20 d30 d42 d对照组15.34±0.0615.41±0.28a15.69±0.10a15.30±0.49a15.68±0.31a试验Ⅰ组15.31±0.0815.05±0.64ab15.12±0.11b15.14±0.22a15.11±0.12b试验Ⅱ组15.29±0.0714.24±0.50b14.69±0.12c14.56±0.19ab14.81±0.15b试验Ⅲ组15.36±0.0614.83±0.12ab14.49±0.06c14.47±0.19b14.85±0.06b%与对照组相比，试验第30 d，试验Ⅲ组肉鸡粪便中粗蛋白含量显著降低了5.42%（P0.05）；试验第42 d，各试验组肉鸡粪便中粗蛋白含量分别显著降低了3.64%、5.55%、5.29%（P0.05）。2.5解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对肉鸡血清生化指标的影响（见表６）由表6可知，与对照组相比，21、42日龄各试验组肉鸡血清总蛋白含量均显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.008.T006表6解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对肉鸡血清生化指标的影响项目21 d42 d对照组试验Ⅰ组试验Ⅱ组试验Ⅲ组对照组试验Ⅰ组试验Ⅱ组试验Ⅲ组总蛋白/(g/L)29.12±1.22b31.56±1.31a33.25±0.69a32.56±0.78a38.75±1.28b43.50±1.68a46.58±0.89a44.12±1.25a白蛋白/(g/L)14.86±1.4014.99±1.2315.52±1.3315.36±1.3614.60±0.8214.90±1.8315.80±0.2415.50±1.36球蛋白/(g/L)13.83±0.8813.99±0.6214.52±1.2214.66±1.0120.75±2.1620.50±3.3322.21±1.9021.67±2.74总胆固醇/(mmol/L)2.23±0.602.32±0.402.43±0.512.60±0.362.75±0.202.72±0.112.70±0.242.73±0.25甘油三酯/(mmol/L)0.24±0.050.26±0.020.29±0.010.30±0.030.30±0.050.33±0.020.39±0.100.38±0.03葡萄糖/(mmol/L)8.54±0.34b9.01±0.32b9.35±0.15ab9.55±0.25a9.95±0.359.99±0.2210.19±0.1210.22±0.22尿素氮/(mmol/L)0.49±0.05a0.46±0.01a0.42±0.04a0.40±0.02b0.58±0.020.56±0.040.52±0.040.50±0.03低密度脂蛋白/(mmol/L)0.54±0.120.52±0.210.48±0.160.47±0.130.75±0.200.73±0.120.67±0.300.60±0.22高密度脂蛋白/(mmol/L)1.72±0.301.83±0.231.89±0.312.26±0.261.85±0.12b1.95±0.15a2.12±0.22a2.40±0.20a谷草转氨酶/(U/L)170.83±1.00a168.11±1.60ab164.02±2.22b163.66±2.06b195.25±2.25a192.50±3.03ab187.21±1.20bc186.67±2.00c谷丙转氨酶/(U/L)9.23±0.20a9.12±0.10a8.73±0.21ab8.50±0.32b13.35±0.4013.32±0.1213.40±0.2013.26±0.1521日龄时，试验Ⅲ组肉鸡血清葡萄糖含量显著提高（P0.05），尿素氮含量显著降低（P0.05），谷丙转氨酶活性显著降低（P0.05）。42日龄时，各试验组肉鸡血清高密度脂蛋白含量明显提高（P0.05），试验Ⅲ组肉鸡血清谷草转氨酶活性显著降低（P0.05）。2.6解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对肉鸡血清免疫指标的影响（见表７）由表7可知，试验21、42 d，与对照组相比，试验Ⅲ组肉鸡血清中IgA、IgM、TNF-α、IL-1、IL-2和IL-6含量显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.008.T007表7解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对肉鸡血清免疫指标的影响组别IgA/(g/L)IgG/(g/L)IgM/(g/L)TNF-α/(μg/L)IL-1/(ng/L)IL-2/(ng/L)IL-6/(ng/L)21 d对照组0.84±0.05b7.50±0.650.86±0.05b28.31±1.21b115.33±3.11d75.50±2.10d20.50±1.33c试验Ⅰ组0.90±0.02ab7.99±0.500.91±0.02ab33.22±3.50b156.21±4.10c82.10±1.11c25.69±2.10b试验Ⅱ组0.95±0.01a8.86±0.640.96±0.05ab36.41±2.50ab190.25±2.12b95.62±2.52b31.55±1.50a试验Ⅲ组0.98±0.03a8.42±0.420.99±0.04a38.32±1.51a220.21±3.00a110.20±2.63a34.22±2.33a42 d对照组0.95±0.05b8.58±1.050.77±0.05b18.60±1.23c94.25±2.12c55.21±2.21c25.00±2.00b试验Ⅰ组0.99±0.02b8.72±0.660.84±0.03ab22.12±2.62bc116.41±2.31b67.20±3.20b27.21±1.21ab试验Ⅱ组1.19±0.10ab8.95±0.780.94±0.02a25.31±2.31a136.52±3.40a78.12±4.11a30.21±1.22a试验Ⅲ组1.07±0.03a8.88±1.100.93±0.05a27.05±1.05a140.20±1.20a80.55±3.41a31.20±2.32a3讨论3.1解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对肉鸡生长性能的影响桂雪儿[9]研究发现，在青年白羽肉杂鸡日粮中添加鸡源复合益生菌可以显著提高其生长性能及胰消化酶活性。张雷等[15]研究发现，白羽乌骨雏鸡饮水中添加复合益生菌可以显著提高雏鸡日增重。雷燕[16]研究发现，饲粮中添加益生菌，肉鸡平均日增重和平均日采食量显著提高，十二指肠淀粉酶、脂肪酶和空肠淀粉酶活性明显提高。肠道是饲料营养物质吸收的主要场所[17]，粪便中粗蛋白含量可以反映动物对饲料中蛋白的吸收利用程度。康永刚等[18]发现，在肉鸡日粮中添加益生菌发酵饲料可以显著减少粪便中氮的排泄。本试验发现，长期添加解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液可提高肉鸡的生长性能，增强胰脏、十二指肠以及空肠中胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，减少粪便中粗蛋白的含量，表明解淀粉芽孢杆菌B-4M-6可促进粗蛋白的消化利用，提高肉鸡的生产性能。3.2解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对肉鸡肠道菌群的影响肠道微生物菌群平衡是维持机体正常生理功能和健康的重要因素[19]。研究表明，益生菌主要通过调节肠道微生物发挥作用，益生菌在动物的肠道中定植，通过产生抑菌物质、产酶、维持肠道平衡以及调节免疫方向促进动物生长[20-21]。李响等[22]研究发现，饲喂益生菌和酶制剂的肉鸡微生物丰富度显著提高。李修宇等[23]在黄鸡日粮中添加复合益生菌和丁酸梭菌均能够明显提高盲肠微生物菌群的丰度，促进回肠绒毛高度并降低隐窝深度。芽孢杆菌可增加厚壁菌门与硬毛菌门的丰度[24]。本试验应用的解淀粉芽孢杆菌B-4M-6来自鸡肠道，可产生抗菌蛋白抑制大肠杆菌生长，并且具有产淀粉酶、蛋白酶与纤维素酶的功能，其发酵液中不仅包含菌体，还含有次级代谢产物，如酶类、抗菌肽、有机酸等。结果表明，解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液可以明显促进双歧杆菌、乳酸菌的数量，降低大肠杆菌和沙门氏菌的数量，在肉鸡生产应用中表现出巨大的潜力。3.3解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液对肉鸡血清生化指标及免疫指标的影响血清生化及免疫指标可以反映动物机体的健康情况。血清总蛋白、球蛋白和白蛋白含量可以反映动物机体对蛋白质的利用情况以及免疫水平。血清中葡萄糖含量升高表示机体的糖代谢能力增强[25]，血清中总胆固醇和甘油三酯代表机体的脂质物质的代谢水平。本试验的解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液可明显提高后期高密度脂蛋白的含量，减少后期肉鸡由于体重快速增长而导致猝死、脂肪肝等症状。谷草转氨酶和谷丙转氨酶是反映肝脏功能的重要指标，其活性高出正常范围表明肝脏出现损伤。本试验中，0.5%解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液可以显著降低试验全期肉鸡血清谷草转氨酶活性，明显降低前期谷丙转氨酶活性，表明对肝脏无不良影响。IgA、IgG、IgM、TNF-α、IL-1、IL-2和IL-6等是动物血液中重要的抗感染物质，在动物体液免疫中起重要作用，其含量越高，表明机体抵御细菌、病毒等疾病的能力越强。研究表明，芽孢杆菌可在肠道内定殖，促进动物中枢器官与组织器官的发育，进入肠道后作用于肠系膜淋巴结发挥特异性免疫作用，可提高IgG和分泌型免疫球蛋白A水平[26]。赵莉等[27]研究发现，在42日龄黄羽肉鸡日粮中添加500 g/t酶联微生态制剂＋1 000 g/t酸化剂，试验28 d，肉鸡血清中白蛋白、IgA、IgG和IgM含量分别提高19.90%、57.14%、37.69%和57.14%。谢富等[6]研究发现，科宝肉鸡全程添加0.1%的复合益生菌可提高IgA、IgG和IgM含量。赵永玉[28]研究发现，AA肉鸡饲粮中添加0.4%复合微生态制剂（枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、酵母菌）可明显提高IgG抗体含量。本试验中，饮水中添加0.5%解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液可显著提高21、42日龄肉鸡血清IgA、IgM、TNF-α、IL-1、IL-2和IL-6含量，从而提高肉鸡的免疫功能。4结论在本试验条件下，肉鸡饮水中添加0.5%的解淀粉芽孢杆菌B-4M-6发酵液（菌含量1.0×109 CFU/mL），能够显著提高肉鸡的生长性能、消化酶活性，促进粗蛋白的吸收利用，增强机体的免疫功能。