中草药饲料添加剂具有绿色、天然、安全等特点，已广泛在畜牧业生产中应用[1]，在促进动物生长、调节免疫功能等方面发挥重要作用[2]。由面粉、麸皮、苦杏仁、赤小豆、青蒿、辣蓼、苍耳草按比例自然发酵而成的六神曲在治疗和预防动物食积、脾胃虚弱等疾病方面具有独特的优势[3]，且具有耐药性低、绿色环保等优点[4]。在六神曲饲料发酵过程中，微生物是影响生产过程的主要因素[5]。基于现代分子生物学技术的高通量测序法被广泛应用于各类发酵产品中的微生物群落分析[6-7]，为更大程度地提升其发酵效果，本研究设计发酵温度、湿度、料液比3因素3水平的正交试验，以中草药发酵过程中淀粉酶和蛋白酶活性为检测指标，对发酵工艺进行优化，并对优化后的微生物群落多样性进行分析，探明发酵中草药群落结构与功能特征，为有效开发和应用六神曲中药饲料添加剂提供参考。1材料与方法1.1试验材料麦麸为市售，面粉购自五得利面粉集团有限公司，苦杏仁、赤小豆、青蒿、辣蓼、苍耳草均购自北京同仁堂药业。1.2主要试剂及仪器主要试剂：淀粉酶检测试剂盒（碘-淀粉比色法，上海尚宝生物科技有限公司）、福林酚试剂（国药集团化学试剂有限公司）、E.Z.N.A.®Soil DNA提取试剂盒（Omega Bio-Tek，U.S.）、AxyPrep DNA Gel提取试剂盒（Axygen Biosciences，U.S.）、Tris_HCL缓冲液。主要仪器：紫外－可见分光光度计（北京普析仪器设备有限公司）、HH-W600恒温水箱（江苏金怡仪器科技有限公司）、Allegra V-15R冷冻型高速台式离心机（贝克曼库尔特公司）、FA2004电子分析天平（天津市天马仪器厂）、KYS-0831高速多功能粉碎机（武义海纳电器有限公司）、HK2002E电磁炉（广东美的有限公司）、303-1b电热恒温恒湿培养箱（尚诚仪器制造有限公司）、NanoDrop-2000（美国Thermo Scientific公司），Gene Amp® 9700型PCR扩增仪（美国ABI公司）、Qubit®3.0荧光定量仪（美国Thermo Scientific公司）。1.3试验方法1.3.1发酵样品制备根据部颁标准配方，按25∶50∶5∶5∶5∶1∶1的比例分别称取面粉、麦麸、辣蓼、青蒿、苍耳草、赤小豆、苦杏仁。将苦杏仁、赤小豆研磨粉碎，与面粉（或麦麸）混匀，过20目筛，倒入经辣蓼、青蒿、苍耳草按不同料液比煎煮后过滤所得滤液内，充分混合并搓成丸。1.3.2正交试验设计（见表1）选择L9（34）正交试验对六神曲发酵条件进行优化。设置发酵温度、发酵湿度、料液比3个因素，在综合六神曲炮制工艺范围的基础上[8]，采用单因素试验，以蛋白酶和淀粉酶活性曲线趋势确定各因素水平。每因素3个水平，共9组处理。正交试验因素水平设计见表1。分别在9组500 mL锥形瓶放入制备好的六神曲样品20 g，覆盖透气封口膜，按正交设计条件分别发酵60 h[9]，每组重复3次。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.T001表1正交试验因素水平设计水平发酵温度/℃发酵湿度/%料液比/(g/mL)130701.00235751.25337801.501.3.3测定指标及方法1.3.3.1酶活性淀粉酶（AMS）、蛋白酶（PRS）活性分别采用碘-淀粉比色法和福林酚比色法测定[10]。1.3.3.2发酵样品微生物总群落将采集样品用干冰包装好后送至南京集思慧远生物科技有限公司进行微生物的高通量测序。PCR扩增体系（20 μL）：4 µL×5 FastPfu Buffer、2 µL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.8 µL Forward Primer（5 µmol/L）、0.8 µL Reverse Primer（5 µmol/L）、0.4 µL FastPfu Polymerase、0.2 µL BSA、10 ng Template DNA。反应条件：95 ℃预热5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。测序引物信息见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.T002表2测序引物信息测序类型测序区域引物名称序列信息测序平台细菌16S rRNAV4-V5515F5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'Hiseq PE250907R5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'真菌ITS1ITS1ITS1F5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'Hiseq PE250ITS1R5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'1.4数据统计与分析对样品测序的原始数据进行过滤，拼接，质控后使用Usearch（V8.1.1861）软件去除嵌合体。以97%相似性对OTU聚类，与已知物种细菌和真菌Silva数据库比对并生成OTU表格，在不同分类学水平下统计群落组成。基于抽平后的OTU分析结果，完成对发酵样品微生物群落的Rank-abundance等级曲线、Alpha、Beta多样性指数等的分析和作图。采用ANOVA单因素方差分析和Duncan's法进行多重检验分析各发酵期内具显著性差异的Alpha多样性指数（P=0.05）。R软件包完成Rank-abundance、Venn、PCoA的计算。采用PICRUSt软件和FUNGuild软件分别对细菌、真菌群落功能基因进行预测分析。试验数据采用Excel 2021软件进行处理和计算，SPSS 25软件进行显著性检验，Origin 2021b软件对相关数据绘图。结果以平均值表示。2结果与分析2.1单因素试验结果（见图1）由图1可知，六神曲发酵样品在温度30、35、37 ℃；湿度70%、75%、80%；料液比1.00、1.25、1.50 g/mL条件下，淀粉酶及蛋白酶活性曲线出现明显拐点，在达到酶活性最高值后明显下降，呈逐渐上升趋势，但是由于温度、湿度、料液比过高均无法为中草药六神曲中微生物提供合适生长环境，因此确定正交试验中各因素的水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F001图1各单因素条件下淀粉酶和蛋白酶活性趋势2.2六神曲发酵条件优化试验结果（见表3、表4）由表3可知，对淀粉酶活性影响程度最大的因素为发酵温度，37 ℃时淀粉酶活性最高；对蛋白酶活性影响程度最大的因素为发酵湿度，80%时蛋白酶活性最高。根据淀粉酶活性的K值可知，活性最高的发酵条件为发酵温度37 ℃、发湿度80%、料液比1.50 g/mL；而根据蛋白酶活性对应K'值可知，活性最高的发酵组合为发酵温度37 ℃、发酵湿度80%、料液比1.00 g/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.T003表3发酵条件正交试验结果项目发酵温度/℃发酵湿度/%料液比/（g/mL）淀粉酶活性/[mg/(min·g)]蛋白酶活性/[μg/(min·g)]130701.0026.70279.50230751.2524.27281.75330801.5027.10285.61435751.2525.62274.47535701.5030.30277.52635801.0029.70298.93737801.5030.92302.66837701.0029.35293.84937751.2529.60284.33淀粉酶活性K178.0786.3585.75K285.6279.4979.49K389.8787.7288.32R11.808.238.83主次顺序：发酵温度料液比发酵湿度蛋白酶活性K'1846.86850.86872.27K'2850.92840.55840.55K'3880.83887.20865.79R'33.9746.6531.72主次顺序：发酵湿度发酵温度料液比根据正交试验结果，以淀粉酶和蛋白酶活性为主要指标，分别验证温度37 ℃、湿度80%、料液比1.50 g/mL（条件1）和温度37 ℃、湿度80%、料水比1.00 g/mL（条件2）两种条件下六神曲发酵情况，结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.T004表4正交试验验证结果项目淀粉酶活性/[mg/(min·g)]蛋白酶活性/[μg/(min·g)]条件131.70302.75条件229.85292.64由表4可知，发酵温度37 ℃、发酵湿度80%、料液比1.50 g/mL条件（条件1）下，六神曲样品中淀粉酶活性31.70 mg/(min·g)，蛋白酶活性302.75 μg/(min·g)，优于条件2。因此，选择六神曲最佳发酵工艺为发酵温度37 ℃、发酵湿度80%、料液比1.50 g/mL。2.3优化后样品发酵过程中微生物群落结构分析结果以正交试验优化条件对六神曲连续发酵60 h，每隔一段时间对其进行观察。根据各时间节点菌丝状态，将样品分为3个发酵时期：前期、中期、后期，各发酵时期菌丝生长状态见图2。分别采集约10 g样品，标记为LSQ01、LSQ02、LSQ03、LSQ04、LSQ05、LSQ06。装入无菌自封袋，置于-80 ℃冰箱内保存，用于后续高通量测序分析。发酵样品分组信息见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F002图2六神曲各发酵时期菌丝生长状态10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.T005表5发酵样品分组信息分组样本时间/h前期LSQ010LSQ0212中期LSQ0324LSQ0436后期LSQ0548LSQ06602.3.1发酵样品序列数特征统计结果（见表6、图3）由表6可知，六神曲发酵过程中细菌与真菌的测序平均条数分别为154 369和214 392，有效序列分别占89%和99%以上，文库覆盖率均高于99%，表明测序数据较好。根据97%相似度划分的1 344和77个OTUs中（未抽平），细菌群落分1 318界1 307门1 210纲1 143目906科507属159种，真菌群落分71界38门32纲29目26科20属16种。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.T006表6发酵样品数据和OTU统计样本细菌真菌有效序列数OTUs抽平后OTU数量有效序列数OTUs抽平后OTU数量LSQ01175 101907869301 7443426LSQ02136 81011851 185211 2622724LSQ03161 689582563151 2665252LSQ04152 222317304267 5554337LSQ05162 402489462173 9461918LSQ06137 995424423180 5834139Rank-abundance丰度等级曲线用于解释物种丰富度和均匀度两个方面。图3发酵样品微生物Rank-abundance丰度等级曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F3a1（a）细菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F3a2（b）真菌由图3（a）可知，在发酵的第12 h曲线下降平缓，在横轴上的范围最宽，表明六神曲在发酵前期，细菌群落物种组成较丰富，群落均匀度高；而发酵的第36 h曲线陡然下降且在横轴上的跨度较小，表明随发酵进行到中后期，细菌群落丰富度和均匀度较低。从总体趋势判断，六神曲在发酵的第0、12 h曲线距离较近，发酵第24、36、48、60 h丰度等级曲线聚集，表明在发酵初期细菌群落较其余时期优势菌种明显。由图3（b）可知，真菌群落与细菌群落物种丰富度和均匀度分布规律不同。发酵第24 h真菌群落物种丰富度和均匀度较高，第48 h物种丰富度和均匀度较其他时间小，群落组成单一。所有样本中，真菌群落分布均较为集中。2.3.2发酵过程中微生物OTU及多样性分析2.3.2.1微生物群落OTU分析采用Venn图直观呈现六神曲发酵过程中细菌与真菌群落OTU分布情况，见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F004图4不同发酵阶段细菌与真菌群落Venn图由图4（a）可知，不同发酵时期细菌群落共有OTU数量424个，占总数31.6%。特有OTU数量分别为497个（前期）、27个（中期）、23个（后期）。由图4（b）可知，不同发酵时期真菌群落共有OTU数量22，占总数的28.9%。特有OTU数量在发酵中期最多，为22；发酵初期最少，为7。在六神曲发酵的各个时期，细菌群落OTU数均明显高于真菌。随着发酵时间的推移，分组样品中细菌群落OTU数目整体呈现降低趋势，真菌群落OTU数目整体则呈现先升高后降低的趋势。发酵初期细菌的OTU数高达1 287个，真菌的OTU数仅为35个；进入发酵中期，细菌的OTU减少到655个，而真菌的OTU数增加到59个；发酵后期细菌与真菌群落的OTU数又逐渐降低到617、43个。研究表明，六神曲在发酵前期细菌种类最多，且前期至中期的变化速率远大于中期至后期的变化速率。真菌群落在发酵中期种类最多，与细菌群落在各时期变化速率类似。可能是细菌与真菌在发酵过程中逐渐适应环境的原因。2.3.2.2发酵样品Alpha多样性分析（见图5、图6、表7）由图5可知，发酵前期细菌菌群丰富度和多样性始终最大，随发酵时间推移，Chao指数、Observed_species指数、PD指数均发生变化。发酵初期Chao指数明显高于中期（P0.05），Observed_species和PD指数明显高于中期和后期（P0.05），而Shannon指数在各发酵期内差异不显著（P0.05）。表明六神曲在发酵前期细菌群落丰富度和多样性较高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F005图5样品发酵过程中细菌多样性指数由图6可知，六神曲发酵过程中真菌较细菌菌群多样性变化不大，发酵中期真菌群落Chao指数、Observed_species指数、PD指数始终最高，Chao指数显著高于发酵初期（P0.05）；发酵后期Shannon指数最高，但在各发酵阶段差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F006图6样品发酵过程中真菌多样性指数由表7可知，分别对比发酵过程中细菌与真菌变化情况可知，六神曲在发酵过程中细菌较真菌群落丰度变化明显。细菌群落中发酵前期各多样性指数始终最高，而在真菌群落中发酵中期的丰富度最高，后期的多样性最高。从整体趋势判断，细菌的多样性指数始终高于真菌，表明六神曲发酵过程中细菌为主导菌群。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.T007表7发酵样品微生物群落Alpha多样性指数发酵时期样品细菌真菌Chao指数Observed_species指数PD指数Shannon指数Chao指数Observed_species指数PD指数Shannon指数前期LSQ01940.09867.0061.762.1831.60265.430.20LSQ021 194.801 185.0080.563.2335.25245.990.41中期LSQ03704.50562.0041.732.5955.755210.570.27LSQ04420.69303.0030.722.0750.00377.580.28后期LSQ05630.20461.0038.832.4432.00183.430.66LSQ06602.03421.0034.762.5642.11398.180.462.3.2.3发酵样品群落beta多样性分析为探究六神曲在不同发酵期，样本内细菌与真菌群落结构的相似与相异关系。在OTU水平上分别基于Bray-curtis、Weighted-Unifrac、Unweighted-Unifrac距离算法计算beta指数。Bray-curtis隶属非进化距离算法，在计算过程中考虑了物种的有无、丰度；Weighted-Unifrac和Unweighted-Unifrac属进化距离算法，二者区别为计算过程中Weighted-Unifrac只考虑物种在样本中存在情况和进化关系，而Unweighted-Unifrac同时考虑物种丰度情况和进化关系。各算法计算的相异系数构建Beta Diveristy热图，见图7。图7细菌与真菌群落beta多样性指数热图注：图中由上到下的3个值分别代表Bray curtis、Weighted-Unifrac、Unweighted-Unifrac距离。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F7a1（a）细菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F7a2（b）真菌由图7可知，由Unweighted-Unifrac表征六神曲发酵过程中两两样本间相异性最大。细菌群落中，LSQ01和LSQ02间相异系数较小，表明物种差异不大；LSQ05和LSQ06间物种差异也不大，而LSQ03和LSQ04间距离较大。真菌群落中发现LSQ03和LSQ04、LSQ01和LSQ02间距离的最小值，而LSQ05和LSQ06间物种差异较大。基于Unweighted-Unifrac距离算法，进一步对六神曲的各发酵时期样本间作三维主坐标分析，见图8。图8不同发酵时期微生物群落PCoA结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F8a1（a）细菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F8a2（b）真菌由图8（a）可知，细菌PC1、PC2、PC3轴分别解释了样品间40.30%、21.44%和15.72%的差异。将样本投影到解释率较高的XY平面可知，发酵前期，LSQ01和LSQ02样本聚集在一起；发酵后期LSQ05和LSQ06样本相近，而LSQ03和LSQ04间距离较远，表明六神曲在发酵中期群落差距较大，物种组成相异。由图8（b）可知，真菌PC1、PC2、PC3轴分别解释了35.12%、25.94%和17.74%的变异，其中PC1和PC2轴共解释了61.06%。所有样本共同向该轴投影发现，LSQ01和LSQ02、LSQ03和LSQ04间样本距离较近，而LSQ05和LSQ06分布于不同象限且距离较远，表明六神曲在发酵前期和中期样本中真菌群落组成结构较为相似，而随着发酵进行，发酵后期真菌群落结构发生明显变化，产生了交替演变。2.3.3群落组成分析2.3.3.1门和属水平上发酵样品细菌群落组成（见图9）图9门和属水平上发酵样品细菌群落组成10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F9a1（a）门水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F9a2（b）属水平由图9（a）可知，各发酵期内相对丰度大于10%的共有优势菌门为变形菌门（Proteobacteria），在前期、中期、后期平均相对丰度分别为93.29%、90.90%和89.18%；而厚壁菌门（Firmicutes）仅为发酵后期的优势菌门，占比10.32%。在发酵前期相对丰度较高的菌门还有Firmicutes、蓝细菌门（Cyanobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）；发酵中期相对丰度较高的菌门为Firmicutes。发酵前期样品中细菌群落组成较为丰富，由Proteobacteria主导，进入发酵中期后其相对丰度逐渐下降，Firmicutes相对丰度逐渐上升，发酵后期Firmicutes逐渐演变为优势菌门。由图9（b）可知，欧文氏菌属（Erwinia）、克罗诺杆菌属（Cronobacter）为3个发酵期共有优势菌属，均以发酵前阶段丰度值最高，到发酵后阶段丰度值最少。Cronobacter相对丰度均达到20%以上，最高值出现在发酵中期。在发酵后期还发现了优势菌属克雷伯氏菌属（Klebsiella），相对丰度占比14.51%，较前、中期优势细菌种类显著提高。各发酵阶段间存在种类相同但占比差距悬殊菌属，如肠球菌属（Enterococcus）在中期和后期逐渐演变为优势菌属，分别占比5.43%和9.47%，是前发酵阶段的10~17倍；类芽孢杆菌属（Paenibacillus）大量分布在发酵中期，到发酵后期其相对丰度仅为0.40%；黑麦草属（Loliumperenne）在发酵前期相对丰度占比较大，到发酵后期逐渐消失；鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）在发酵前期相对丰度分别是发酵中期和后期的7倍和6倍。2.3.3.2门和属水平上发酵样品真菌群落组成（见图10）图10发酵样品真菌门、属水平上群落组成10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F10a1（a）门水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F10a2（b）属水平由图10（a）可知，真菌群落中，子囊菌门（Ascomycota）是各发酵期内共有优势菌门，相对丰度均达到97%以上，并在发酵后期最高。其余菌门如被孢菌门（Mortierellomycota）在六神曲发酵的各时期差距不大。随发酵时间进行，担子菌门（Basidiomycota）在发酵前期和中期无明显变化，后期减小为1/2倍。蛙粪霉门（Basidiobolomycota）在发酵中期有少量分布，未见于前和后发酵阶段。由图10（b）可知，曲霉属（Aspergillus）始终为各发酵阶段共有优势菌属，在发酵后期相对丰度最大，达84.14%。其余菌属在不同发酵阶段分布各异。前期样本中主要菌属镰刀菌属（Fusarium），占比3.55%，耐干霉菌属（Xeromyces）占比1.43%。中期样本中主要菌属Fusarium占比6.30%，拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis）占比1.61%，白僵菌属（Beauveria）占比1.19%。后期Fusarium、木霉属（Trichoderma）为主要菌属，分别占比2.45%和2.39%。Trichoderma隶属于丝孢纲，用于控制疾病和增加产量[11]。本研究发现，Trichoderma为发酵前期和后期共有优势菌属，但未见于发酵中期。Pestalotiopsis常为分生孢子形态[12]，是一种相对重要的植物病原属，时常引起植物枯萎病[13]，本研究中Trichoderma仅存在于发酵中期。Xeromyces更喜欢水分活动较低的含糖底物，目前正在成为一种重要的经济食品腐败剂[14]，在六神曲发酵的前期、中期均有分布，而未见于发酵后期。Beauveria为发酵中期和后期共有菌属。2.3.3.3发酵样品细菌、真菌群落在门和属水平上差异物种（见图11）由图11（a）可知，在门水平上，六神曲发酵样品在Firmicutes和Cyanobacteria上存在明显差异，Firmicutes在发酵后期显著高于前期，与中期无明显差异；Cyanobacteria分别在发酵前期和中期与前期和后期存在明显差异。由图11（b）可知，在属水平，Cronobacter、Klebsiella、Lolium perenne在各发酵期内存在明显差异。Cronobacter和Klebsiella相对丰度均表现为发酵后期明显高于发酵前期和中期，Lolium perenne在发酵前期相对丰度明显高于中期和后期。而在真菌群落中未发现具显著性差异的菌种。图11发酵样品细菌群落门和属水平上组成10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F11a1（a）门水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F11a2（b）属水平2.3.4六神曲发酵样品微生物功能预测2.3.4.1细菌PICRUSt功能预测（见表8、图12、图13）利用PICRUSt软件对六神曲发酵过程中细菌功能变化进行预测分析，并与KEGG数据进行比对。由表8可知，共获得6类一级生物代谢通路，在六神曲发酵的不同时期丰度变化不大。新陈代谢为主要功能，在发酵前期相对丰度最高，变异系数较大，为强变异；其次为环境信息处理，在发酵中、后期相对丰度最高，均为弱变异；遗传信息处理在六神曲发酵后期相对丰度最高，为弱变异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.T008表8六神曲各发酵时期细菌一级功能预测一级功能前期中期后期平均值变异系数平均值变异系数平均值变异系数细胞过程4.301.504.102.804.000.30环境信息处理16.601.7017.400.3017.400.40遗传信息处理11.701.3011.702.1011.800.80人类疾病1.301.301.200.501.200.20新陈代谢65.100.0364.600.1064.700.02有机体系统1.000.020.902.700.900.30%由图12可知，各时期内R（一般功能）、S（未知型功能）、E（氨基酸转运及代谢）、G（碳水化合物转运及代谢）代表的COG功能丰度均最高，尤其在发酵后期。丰度最低的4种功能分别为A（RNA加工、修饰）、B（染色质结构 动力学）、Z（细胞骨架）、W（真核细胞胞外结构）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F012图12六神曲发酵不同时期COG功能箱线图注：R为一般功能，S为未知型功能，E为氨基酸转运及代谢，G为碳水化合物转运及代谢，K为转录，C为能源生产和转换，M为细胞壁、膜、被膜生物发生，P为无机离子的传输和代谢，J为翻译、核糖体结构与生物发生，H为辅酶的转运和代谢，L为复制、重组和修复，T为信号传导机制，O为翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣，I为脂质运输和新陈代谢，U为细胞内运输、分泌和囊泡运输，F为核苷酸运输和代谢，N为细胞运动，Q为次级代谢物生物合成，V为防御机制，D为细胞周期控制、细胞分裂、染色体分裂，A为RNA加工、修饰，B为染色质结构动力学，Z为细胞骨架，W为真核细胞外结构。由图13可知，进一步对相对丰度排名前10的COG功能进行差异分析，仅COG1609和COG1263在各时期间存在显著差异（P0.05）。COG1609丰度在发酵前期显著低于后期（P0.05），COG1263丰度在发酵中期和后期均显著高于前期（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.F013图13丰度排名前10 COG功能差异分析2.3.4.2FUNGuild鉴定的各发酵期内5种生态功能（见表9）由表9可知，利用FUNGuild对六神曲发酵过程中真菌类群进行功能预测，共鉴定出5类生态功能群。腐生营养型真菌相对丰度在各个时期占比均最高，达99%以上，尤其在发酵前期，表明该时期样本中存在大量腐生真菌；腐生-共生营养型、共生营养型真菌仅存在发酵中期；病理营养型真菌则仅存在发酵中期和后期，但其值影响不大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.03.019.T009表9FUNGuild鉴定的各发酵期内5种生态功能功能前期中期后期平均值变异系数平均值变异系数平均值变异系数腐生营养型99.980.000 1899.430.002 5099.870.000 42腐生-共生营养型000.081.000 0000病理营养型000.180.280 000.021.000 00共生营养型000.021.000 0000病理-腐生-共生营养型0.021.000 000.300.340 000.110.600 00%3讨论3.1中草药六神曲饲料添加剂发酵条件优化分析研究发现，中草药在发酵过程中产生的酶类物质能够有效促使某些活性成分演变为新的活性物质[15-16]，在应用过程中能够显著提高饲料转化率，促进动物生长，并改善肉质风味[17]。发酵温度、发酵湿度和料液比是影响发酵阶段最主要的因素[18]。其中温度显著影响了参与动物细胞内生化反应的酶活性[19]。本试验中，淀粉酶和蛋白酶活性受温度变化影响存在差异。饲料中淀粉酶和蛋白酶含量较高为宜，在选择上应同时考虑二者最适温度条件，以保证活性均达到最高。发酵过程中，湿度过低会导致表面微生物生长不完全，过高可能引起成品腐烂[20]。本研究的最适湿度为80%，在正常范围内。物料含水量主要影响了氧气间的流动，进而间接控制微生物生长。本试验优化的最佳料液比为1.00、1.50 g/mL，结合验证试验结果可得各指标值均达到最高，综合各项指标发现，六神曲发酵温度为37 ℃、发酵湿度80%、料液比1.50 g/mL条件最优。3.2发酵中草药六神曲微生物群落多样性分析本研究发现，细菌类始终是主导菌群，与陈彦琳等[21]研究结论存在差异。各发酵期分组样品内OTU数目在细菌群落中整体呈降低趋势，而在真菌群落中呈先升高后降低的趋势，但总体未能超过细菌群落，与Xu等[22]研究认为六神曲在前发酵阶段以细菌群落为主，后发酵阶段以真菌群落为主的观点不一致。细菌群落中，发酵前期多样性较为丰富，以Proteobacteria、Firmicutes、Cyanobacteria、Bacteroidetes为主，能够有效调节动物肠道菌群，抑制部分有害菌繁殖[23]。到发酵中期和后期，除Firmicutes相对丰度升高外，其余菌门的相对丰度均下降。原因可能是随发酵进行，Firmicutes更适应高酸和缺氧环境[24]，而Erwinia、Cronobacter始终为各发酵阶段优势菌属，且两者均为有害菌。对商业六神曲产品的微生物群落多样性研究中也有报道[25]，在饲料发酵应用中应重点关注原料选择方面。真菌群落中，Ascomycota相对丰度均在97%以上，作为发酵过程中的优势菌门得到广泛报道，与以往对食品、中药发酵的研究结论基本一致[26]。Aspergillus始终为各发酵期共有优势菌属，与王秋红等[27]研究结论类似。Liu等[28]研究发现，六神曲发酵过程中产生的米曲霉能够产生淀粉酶、糖淀粉酶等蛋白酶和消化酶，与神曲的食欲刺激和消化功能有关。本研究中，Aspergillus大量存在于发酵后期，应重点关注六神曲发酵产生霉菌的种类是否有害。本研究结果显示，新陈代谢在发酵前期相对丰度最高，为强变异；环境信息处理、遗传信息处理在发酵中、后期相对丰度最高，均为弱变异，可能是由于发酵初期，菌体快速生长和大量繁殖导致细菌主要集中在与微生物生长相关的代谢途径上；到发酵后期，优势微生物的大量繁殖导致有害微生物受到拮抗抑制作用，故菌体生长逐渐转向关键代谢产物的合成。对真菌类群的功能预测表明，腐生型真菌在全部发酵样品中占比最高，不同发酵期内真菌相关营养型和生态功能群间存在显著差异，可能与在真菌门水平上发现的子囊菌门大量存在有关。4结论本研究表明，六神曲发酵饲料添加剂最优条件为发酵温度37 ℃、发酵湿度80%、料液比1.50 g/mL，此时淀粉酶和蛋白酶活性较高，与动物消化相关的优势菌群丰富度提高。