2020年农业农村部宣布禁止在饲料中添加抗生素，因此需要寻找绿色健康的饲料添加剂替代抗生素。乳酸菌作为肠道内重要的益生菌，能够直接影响家禽机体发育，抑制肠道内有害菌群生长，提高家禽免疫系统性能[1]。与抗生素相比，益生菌具有无耐药性、无毒、无残留的优势[2]，是替代抗生素的优质选择。在人和动物体内大量存在的乳酸菌具有提高动物生长性能[3]、增强免疫力[4-5]、改善肠道菌群[6-7]和防治疾病[8]等作用。本研究从健康的海兰褐蛋鸡盲肠内容物内的分离菌株，对其采取菌落形态观察、革兰氏染色镜检、16S rDNA基因序列分析、生长和产酸性能的曲线绘制、通过耐酸、耐高温、耐低温、耐盐性的试验，以选出优质的乳酸菌，为菌种资源在养殖业中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品来源海兰褐蛋鸡盲肠内容物采自新疆阿克苏地区温宿县某蛋鸡养殖场。选取5只健康22周龄海兰褐蛋鸡屠宰，将盲肠内容物放入无菌的冻存管保存，标记编号和日期后放入液氮罐保存，带回实验室后放入-80 ℃冰箱保存。1.1.2培养基MRS琼脂培养基：蛋白胨10 g、牛肉浸粉8 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸氢二铵2 g、乙酸钠5 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.04 g、琼脂14 g、吐温80 1 g/L，pH值（6.5±0.2），购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。MRS肉汤培养基：蛋白胨10 g、牛肉浸粉8 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氢二钾2 g、柠檬酸氢二铵2 g、乙酸钠5 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.04 g、吐温80 1 g/L，pH值（5.2±0.2），购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。生长曲线和产酸曲线所使用的MRS肉汤培养基中加入适量氢氧化钠稀释液，pH值约7.1。1.2仪器设备超净工作台（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）、超低温冰箱（中科美菱低温科技股份有限公司）、全自动高压灭菌锅（致微（厦门）仪器有限公司）、光学显微镜（日本尼康公司）、电热恒温培养箱（海博讯医疗生物仪器股份有限公司）、智能恒温培养振荡器（天津欧诺仪器股份有限公司）、便携式pH计（希玛仪表集团有限公司）、紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）、琼脂糖电泳（中科瑞泰生物科技有限公司）、4 ℃冰箱（美的集团股份有限公司）。1.3测定指标及方法1.3.1乳酸菌的分离取盲肠内容物置于高压灭菌过后分装的MRS肉汤培养基中，充分混匀，放入恒温培养箱中37 ℃过夜培养18~24 h。在超净台内，使用接种环将培养好的菌液进行三区划线，接种至含有1%碳酸钙（CaCO3）的MRS固体培养基上，放入37 ℃恒温培养箱内培养24 h。挑选溶钙圈明显的单独菌落，在MRS固体培养基上进行1~3区划线，37 ℃再培养24 h。以上步骤反复进行3~4次，直至分离出形态结构一致的单菌落。1.3.2乳酸菌菌落的形态观察将分离出的疑似乳酸菌涂布于滴加无菌生理盐水的载玻片上进行革兰氏染色，光学显微镜观察细菌形态。1.3.3菌液制备将纯化分离出的疑似乳酸菌进行活化，接种至3 mL的MRS液体培养基，放入恒温培养振荡器内，37 ℃、150 r/min培养24 h，置于4 ℃保存。1.3.416S rDNA基因序列使用细菌DNA提取试剂盒提取已分离出的乳酸菌DNA，采用V3区通用引物（338F：5'-CCTACGGGA-GGCAGCAG-3'，518R：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'[9]，扩增片段1 500 bp）进行DNA扩增，PCR扩增方法参考白长胜等[10]。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将PCR产物送至上海派森诺生物科技公司进行测序。结果在NCBI核酸数据库中使用BLAST法进行对比搜索，选择几株同源性较高的菌株，使用MEGA 7.0软件绘制发育树[11]。1.3.5生长曲线的绘制保存的乳酸菌37 ℃活化24 h，按1%的接种量接种至无菌pH值为7.1的MRS肉汤培养基，取100 μL分离后的菌液，滴入200 mL MRS肉汤培养基，混匀，吸取5 mL液体置于12个无菌细菌瓶，放入恒温培养振荡器中37 ℃、150 r/min培养24 h。分别在培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h时取出，使用紫外分光光度计测量菌液的OD600 nm值，以培养时间为横坐标，OD600 nm值为纵坐标，Origin 2021软件绘制生长曲线[12]。1.3.6产酸曲线的绘制方法同1.3.5，使用便携式pH计测定各个培养时间菌液的pH值，以培养时间为横坐标，pH值为纵坐标，Origin 2021软件绘制产酸曲线[13]。1.3.7耐受性试验保存的乳酸菌活化后，按1%接种量接种至MRS肉汤培养基中，分别在10、15、45、50 ℃条件下培养24 h，观察其生长状况。保存的乳酸菌活化，按1%接种量接种至不同pH值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、7.0）的MRS肉汤培养基中，37 ℃培养24 h观察生长状况。保存的乳酸菌活化后，按1%接种量接种至不同NaCl含量（3.0%、6.5%）的MRS肉汤培养基中，37 ℃培养24 h观察生长状况。2结果与分析2.1分离菌株培养基观察结果（见图1）由图1可知，观察分离菌株的培养基发现有2株疑似乳酸菌，命名为JZ1、JZ2。菌落边缘区分明显，有凸起，整体呈乳白色，有芳香味，出现明显溶钙环。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.013.F001图1分离菌落培养基观察结果2.2革兰氏染色镜检结果（见图2）由图2可知，通过镜检观察，菌株呈蓝紫色，单独或成对存在，两端钝圆，呈杆状，无芽孢，鞭毛。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.013.F002图2革兰氏染色镜检结果（1 000×）2.3分离菌株的PCR电泳结果（见图3）由图3可知，将两菌株PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，产物在1 500 bp出现明显且唯一的条带，与预期片段结果相符。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.013.F003图3分离菌株的PCR电泳结果注：M为DL2000 maker；1为JZ1，2为ZJ2。2.4PCR序列与发育树分析（见图4）由图4可知，菌株JZ1与唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius strain MW867011.1）为同一支，同源性为99.85%，鉴定为唾液乳杆菌；菌株JZ2与敏捷乳杆菌（Lactobacillus agilis strain MT573793.1）为同一支，同源性为99.78%，鉴定为敏捷乳杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.013.F004图416S rDNA基因序列分析2.5JZ1和JZ2生长曲线（见图5）由图5可知，JZ1和JZ2在0~4 h均为生长迟缓期，OD600 nm值变化不明显。JZ1菌株在4~10 h为对数生长期，繁殖迅速，10 h进入平台期；JZ2在4~10 h为对数生长期，10 h进入平台期。JZ1和JZ2菌株均在10 h进入平台期，但在对数期JZ1菌株的长势更快，而JZ2菌株长势较慢，可能与pH值为7.1的培养基有关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.013.F005图5JZ1和JZ2生长曲线2.6JZ1和JZ2的产酸曲线测定结果（见图6）由图6可知，JZ1在2~10 h产酸量增加显著，在12 h后进入平稳期，产酸量减少，培养24 h后pH达到4.2左右，产酸效果显著。JZ2在4~10 h产酸量增加，在12 h后进入平稳期，24 h培养结束pH达到5.3左右。两株菌进行对比，以JZ1产酸能力较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.013.F006图6JZ1和JZ2的产酸曲线测定结果2.7JZ1和JZ2菌株的耐受性试验结果（见表1）由表1可知，在耐酸试验中，pH值小于3.0时，两株菌均不能生长；pH值为3.0、3.5时，JZ1生长缓慢，JZ2不生长；当pH值为4.0时，JZ1生长效果良好；JZ2在pH值为4.0、4.5条件下生长缓慢；JZ1在pH值大于4.5时生长效果最佳，JZ2在pH值为7.0时生长效果最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.013.T001表1JZ1和JZ2菌株的耐受性试验结果项目JZ1JZ2pH值2.5--3.0+-3.5+-4.0+++4.5++++7.0++++++温度/℃10--15+++45+++++50--NaCl/%3.0++++++6.5+-注：“-”表示不生长，“+”表示生长效果差，“++”表示生长效果良，“+++”表示生长效果佳。在耐温试验中，两株菌在10、50 ℃的条件下均不生长，在15、45 ℃环境下均能够生长，JZ1生长效果均优于JZ2。在耐盐试验中，两株菌在3%的NaCl条件下生长效果优良；在6.5%的NaCl条件下，JZ1能够生长但是效果较差，JZ2不生长。研究表明，JZ1的耐酸性、耐高温、耐低温和耐盐性效果均优于JZ2。3讨论本研究从新疆阿克苏地区蛋鸡的盲肠食糜分离出JZ1为唾液乳杆菌，JZ2为敏捷乳杆菌，均属于乳杆菌（Lactobacillus）属乳酸菌[14]。Shokryazdan等[15]研究发现，唾液乳杆菌能够有效提高肉鸡的生产性能、降低肠道有害菌的繁殖和血脂的功能。Khan等[16]研究发现，敏捷乳杆菌具有提高机体抗氧化能力、抗炎和抗糖尿病的功能。Hong等[17]采用唾液乳杆菌和敏捷乳杆菌联合饲喂蛋鸡，发现产蛋性能、蛋品质、蛋白氨基酸水平明显提高，大肠杆菌等有害菌的菌群丰度明显降低。本研究分离后得到的JZ1和JZ2菌株在培养4~10 h时为对数生长期，繁殖迅速，10 h后达到平台期，在24 h培养期内，JZ1菌株生长趋势显著高于JZ2菌株；JZ1的产酸能力在培养24 h的pH值约达到4.2，JZ2的pH值约达5.3。张磊等[18]对黄羽肉鸡消化道从所分离出的14株唾液乳杆菌进行生长性能测定，发现WLS004菌株在3.5~10.0 h为对数期，与本研究的JZ1菌株结果一致。梁颖等[19]对从三黄鸡肠道中分离的3个乳酸菌菌株进行评定，结果显示，3株乳酸菌的对数期生长期均为4~10 h，与本研究结果相似。吴雨晗等[20]对从安庆六白猪猪粪中分离出的约翰氏乳杆菌进行评定，研究发现，乳杆菌在4 h后进入对数生长期，16 h后进入平稳期，最终培养24 h的pH值达3.4。何江波等[21]对来源于黑藏羊和白绒山羊瘤胃中的乳酸菌进行生理测定，结果显示，8株戊糖片球菌在4 h后进入对数生长期，16 h后进入平稳期，pH值最终均低于4.0；8株肠球菌在2 h后进入对数生长期，12 h后进入平稳期，pH值均约为4.2~4.5。本试验发现，JZ1菌株具有生长速度快和产酸能力强的优势，而JZ2的生长和产酸能力均显著低于JZ1菌株，原因可能与试验所配制的pH值为7.1的MRS肉汤培养基有关，具体原因还需后续试验进行研究。通过耐受性试验结果显示，菌株JZ1在pH值为3.0条件下可以生长，耐酸能力优秀，与陈新亮等[22]所分离出的唾液乳杆菌结果一致。本试验中，在15、45 ℃环境中，JZ1和JZ2均能够生长，表明两株菌均具有不错的耐高温和耐低温的能力。JZ1在3.0%和6.5% NaCl环境中能够生长，耐盐能力强，与汤凯等[23]分离出的5株乳酸菌结果相似。4结论本试验结果表明，从海兰褐蛋鸡盲肠食糜分离出的JZ1和JZ2菌株，分别为唾液乳杆菌和敏捷乳杆菌，通过生长和产酸能力测定，JZ1生长速度快和产酸能力强，具有良好的耐酸、耐高温、耐低温和耐盐的能力，更适合作为畜牧养殖中的优质菌源。