生物活性肽是指具有生理功能的肽类物质，由于分子较蛋白质小，更易被生物体吸收利用[1]。研究发现，许多活性肽具有免疫调节活性、抗炎作用、抗氧化活性或血管紧张素转化酶（ACE）抑制性等功能[2]。抗氧化肽能够广泛在食品、饲料添加剂等方面应用，可作为抗氧化剂在疾病治疗中发挥重要作用，具有广阔的开发前景[3-5]。抗氧化肽的制备方法主要有酶解法、微生物发酵法、化学合成法和基因工程重组法等。酶解法是制备抗氧化肽最常见的方法。由于酶作用的专一性使此法具有特异性强的优点，且工艺较成熟，但制备成本高。基因工程重组法用于表达短肽链的抗氧肽难度大，效率低，只适合制备大分子肽。化学合成法制备抗氧肽由于生产成本高、副反应多，限制了其大规模的应用。微生物发酵法是一种利用菌体生长代谢过程中产生蛋白酶而水解底物蛋白制备抗氧化肽的方法，具有成本低、操作简单、易于投入大量生产等优点[6-7]。金针菇（Flammulina velutipes）又名毛柄小火菇、构菌、朴菇、朴蕈等，营养丰富，具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性，是我国重要的药食两用菌之一[8-10]。金针菇蛋白质含量高，是活性肽开发和生产的极好原料，但目前尚无关于利用发酵法制备金针菇抗氧肽的报道。本研究通过益生菌发酵法制备金针菇抗氧化肽，以期丰富金针菇抗氧化肽的研究内容，为金针菇抗氧化肽的开发利用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂金针菇购自黑龙江省绥化市北林区农贸市场。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger）由绥化学院微生物实验室提供。牛肉膏、蛋白胨为生物试剂纯（BR），购自北京奥博星生物技术有限责任公司；ABTS、过硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硝酸钠、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁等均为分析纯试剂，购自上海埃彼化学试剂有限公司。菌种活化用的牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基及查氏培养基配方参见文献[11]。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨 10.0 g、氯化钠5.0 g，pH值7.2，121 ℃高压灭菌20 min。PDA培养基：马铃薯洗去泥土，去皮，使用天平称取去皮马铃薯200 g，切成薄片（或小块），加水1 000 mL煮沸30 min出汁，两层纱布过滤，收取全部滤液，向滤液中加入葡萄糖（或蔗糖）20 g，补充水至终体积1 000 mL。查氏培养基：分别称取蔗糖或葡萄糖30 g、硝酸钠或硝酸钾2 g、磷酸氢二钾或磷酸二氢钾1 g、氯化钾0.5 g、硫酸镁0.5 g、硫酸亚铁0.01 g，依次加入1 L水中，搅拌至全部溶解，加琼脂20 g。1.2主要仪器LX-100型立式压力蒸汽灭菌器购自深圳良谊实验室仪器有限公司，752型紫外可见分光光度计购自上海菁华科技仪器有限公司，SHA-B型水浴恒温振荡器购自上海新乘仪器设备有限公司，JR-750A型万能粉碎机购自浙江金华永康市云达机械设备厂，TGL-20bR型高速冷冻离心机购自上海安亭科学仪器厂，GZX-9030 MBE型数显鼓风干燥箱购自上海博迅实业有限公司，pHS-3C型酸度计购自上海雷磁仪器有限公司，超滤离心管（截留分子量分别为3、10 kD）购自美国Millipore公司。1.3测定指标及方法1.3.1金针菇抗氧化肽的抗氧化性测定金针菇抗氧化肽的抗氧化性使用其对ABTS自由基的清除率表示[12]。ABTS工作液的配制：精确称取40.00 mg ABTS，依次加入10 mL蒸馏水和8.00 mL 1.0 g/L的过硫酸钾，室温避光反应12~16 h，在250 mL容量瓶中使用pH值7.4的PBS缓冲液定容，静置10 h。吸光值A1：在比色管中加入0.5 mL金针菇抗氧化肽溶液，加入1.5 mL磷酸盐缓冲溶液（PBS）补至2 mL，加入2 mL已配制好的ABTS工作液混合，静置30 min，734 nm波长下测定吸光值。吸光值A2：在比色管中加入0.5 mL金针菇抗氧化肽溶液，加入1.5 mL PBS溶液补至2 mL，加入2 mL蒸馏水，静置30 min，734 nm波长下测定吸光值。空白吸光值A0：在比色管中加入2 mL PBS溶液，加入2 mL ABTS工作液，静置30 min，734 nm波长下测定吸光值。ABTS自由基清除率=[A0-(A1-A2)/A0]×100%(1)1.3.2金针菇抗氧肽的制备及益生菌的筛选利用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和黑曲霉进行筛选，筛选出在金针菇发酵过程中能够产生蛋白酶并高效降解金针菇大分子蛋白产生抗氧肽的菌株[13-14]。1.3.2.1菌种活化枯草芽孢杆菌使用牛肉膏蛋白胨培养基于37 ℃、150 r/min振摇培养约24 h，取菌悬液于600 nm处测定OD值，当OD值为0.1时停止培养，菌体含量约为1×106~1×107 CFU/mL[15]。酿酒酵母使用PDA培养基于28 ℃、150 r/min振摇培养36 h。黑曲霉使用查氏培养基在恒温培养箱中28 ℃静置培养5 d，至孢子成熟后使用无菌水制成孢子悬液。适当稀释使酿酒酵母菌和黑曲霉孢子含量约为1×108 CFU/mL（采用血球计数板直接计数法）[16]。1.3.2.2益生菌筛选洗净的金针菇子于50 ℃下烘干，使用万能粉碎机粉碎，过80目筛，获得金针菇干粉，称3 g蔗糖溶于150 mL蒸馏水中，加入40 g金针菇干粉，搅拌均匀，放入500 mL三角瓶中，121 ℃灭菌20 min。待培养基冷却后将活化好的菌悬液或孢子悬液2 mL接种至固体培养基中，混匀，发酵。枯草芽孢杆菌的发酵温度设置为37 ℃，酿酒酵母和黑曲霉菌的发酵温度设为28 ℃，发酵时间均为96 h。发酵过程中每24 h振荡一次，发酵结束后，样品在45 ℃干燥箱中干燥24 h，加入蒸馏水，充分混合，离心，取上清液，使用pH值沉淀法得到金针菇抗氧化肽，沉淀，使用蒸馏水复溶，计算ABTS自由基清除率，筛选出所产抗氧化肽抗氧化活性最强的菌种[17-20]。1.3.3pH值沉淀法分离金针菇抗氧化肽及最佳pH值的筛选发酵完成后，发酵瓶在45 ℃干燥箱中干燥24 h，加入蒸馏水，搅拌均匀，离心取上清液，采用酸度计分别在pH值3、4、5、6、7、8、9进行测试，利用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调节pH值，分别测定在各pH值所获得的金针菇肽沉淀物对ABTS自由基的清除率，筛选出最适合沉淀抗氧化肽的pH值。1.3.4单因素试验1.3.4.1液料比对发酵金针菇产抗氧化肽的影响取40 g金针菇干粉5份于500 mL三角瓶中，各加蔗糖3 g，按液料比3.25、3.75、4.25、4.75、5.25 mL/g分别加蒸馏水，利用筛选出的最适菌种在37 ℃下发酵48 h。发酵结束后，将样品在45 ℃干燥箱中干燥24 h，加入蒸馏水，充分混合，离心，取上清液，使用pH值沉淀法在筛选出的最适pH值下得到金针菇抗氧肽，依次测定金针菇抗氧肽对ABTS自由基的清除率。1.3.4.2发酵时间对发酵金针菇产抗氧化肽的影响金针菇干粉用量40 g、蔗糖3 g、液料比4.25 mL/g、发酵温度37 ℃时，分别设定发酵时间为12、24、36、48、72 h，测定金针菇抗氧肽对ABTS自由基的清除率。1.3.4.3发酵温度对发酵金针菇产抗氧肽的影响金针菇干粉用量40 g、蔗糖3 g、液料比4.25 mL/g、发酵时间48 h时，设置发酵温度为23、28、32、37、40 ℃，分别测定金针菇抗氧肽对ABTS自由基的清除率。1.3.4.4金针菇用量对发酵金针菇产抗氧化肽的影响液料比为4.25 mL/g、蔗糖3 g、发酵温度37 ℃、发酵时间48 h时，分别设置金针菇干粉用量为20、40、60、80、100 g，分别测定金针菇抗氧化肽对ABTS自由基的清除率。1.3.5响应面试验设计以单因素试验为依据，利用Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behnken进行响应面设计及分析，确定益生菌发酵法制备金针菇抗氧化肽的最佳条件[21-24]。响应面因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.T001表1响应面因素水平设计水平A液料比/(mL/g)B发酵时间/hC发酵温度/℃D金针菇用量/g-13.7512324004.2524376014.753640801.3.6超滤法分级分离抗氧化肽将最适发酵条件下获得的金针菇抗氧肽使用pH值沉淀法分离，使用蒸馏水复溶，经0.22 μm微孔滤膜过滤，使用截留3、10 kDa分子量的超滤离心管进行离心，将抗氧肽分离成3个截留分子量区间：小于3 kDa、3~10 kDa、大于10 kDa。研究不同分子量肽的抗氧性。1.4数据统计与分析每组试验均重复3次，试验所获得数据采用Excel 2010软件进行分析处理并制图。2结果与分析2.1黑曲霉和枯草芽孢杆菌对ABTS自由基清除率的影响（见表2）发酵结束后，在金针菇固体培养基上并未见酿酒酵母的菌落生长，可见金针菇固体培养基不适合酿酒酵母生长。由表2可知，枯草芽孢杆菌为制备金针菇抗氧肽的最佳菌种，最适合沉淀金针菇抗氧化肽的pH值为6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.T002表2黑曲霉和枯草芽孢杆菌对ABTS自由基清除率的影响项目pH值3456789黑曲霉70.3273.5175.6479.4577.5776.8772.39枯草芽孢杆菌90.2194.9095.3896.2794.6592.5490.12%2.2单因素试验结果2.2.1液料比对ABTS自由基清除率的影响（见图1）由图1可知，液料比对ABTS自由基清除率的影响曲线呈先升高后降低的趋势，在液料比为4.25 mL/g处达到最大值。原因可能是固态发酵时培养基的含水量直接影响微生物的生长和发酵。任何一种微生物对其赖以生长的培养基中的含水量均有一定要求。若培养基中的含水量太高，可能会导致菌体细胞过度吸水后胀破，影响培养基的通气性，使菌体细胞的呼吸受到限制，影响发酵水平；若培养基中含水量太低，则可能会使菌体细胞过度失水，发生质壁分离，使细胞代谢活动异常甚至死亡。而微生物的生长状态直接影响蛋白质水解酶的分泌，从而影响抗氧化肽的形成[25]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.F001图1液料比对ABTS自由基清除率的影响2.2.2发酵时间对ABTS自由基清除率的影响（见图2）由图2可知，发酵时间为12~24 h时，ABTS自由基清除率呈增加趋势，但超过24 h后曲线开始下滑，所以选择最佳发酵时间为24 h。原因可能是枯草芽孢杆菌在发酵时间12~24 h内生长旺盛，蛋白质水解酶分泌能力强，从而促进了抗氧化肽的积累。而随着发酵时间继续延长，菌体细胞大量繁殖，培养基中营养物质不断被耗尽，菌体生长逐渐进入衰亡期，造成蛋白质水解酶分泌量减少，从而影响抗氧化肽的形成[25]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.F002图2发酵时间对ABTS自由基清除率的影响2.2.3发酵温度对ABTS自由基清除的影响（见图3）由图3可知，在发酵温度为23~37 ℃时，抗氧化肽的ABTS自由基清除率逐渐上升，在37 ℃时达到最高值，之后曲线呈下降趋势。因此，37 ℃为最佳发酵温度。原因可能是在较低或较高温度时，枯草芽孢杆菌的生长和繁殖速度缓慢，代谢水平较低，导致抗氧肽的形成受阻。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.F003图3发酵温度对ABTS自由基清除率的影响2.2.4金针菇用量对ABTS自由基清除的影响（见图4）由图4可知，金针菇用量对ABTS自由基清除率呈先升高后降低的趋势，在金针菇用量为60 g时达到峰值，因此选择最佳金针菇用量为60 g。原因可能是金针菇用量适当加大，可增加培养基中营养物的供给以满足菌体生长过程中对营养的需求；但在培养瓶容积和液料比一定的前提下，金针菇用量过多，引起瓶装量过大，导致瓶中供氧量不足，从而影响菌体的生长和蛋白酶的分泌以及抗氧肽的产生。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.F004图4金针菇用量对ABTS自由基清除率的影响2.3响应面试验及方差分析结果（见表3、表4）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.T003表3响应面试验结果试验号ABCDABTS自由基清除率/%1-10-1088.852-100-191.513100-194.264110092.385100191.1460-10191.85701-1090.2880-10-190.139010190.2310-100191.5611001192.8412011092.4913000094.2114-1-10090.8215001-191.23161-10090.2817101091.0818000095.2519-110089.812000-1-193.6821000095.562200-1189.3723010-194.62240-11089.85250-1-1091.1926000094.4727-101091.512810-1091.6529000094.62利用软件Design-Expert 8.0.6对数据进行分析，进行二次多元回归拟合，得到二次多元回归方程为：ABTS自由基清除率R=-252.230 29+82.360 67A-0.118 80B+9.322 73C+0.078 571D+0.129 58AB-0.403 75AC-0.079 250AD+0.018 490BC-6.364 58×10-3BD+0.018 5CD-7.654A2-0.014 087B2-0.12 608C2-2.418 13×10-3D2。由表4可知，模型的P0.000 1，表明该回归方程模型极显著，且模型失拟值P=0.927 40.05不显著，相关系数R2=0.976 9，R2adj=0.953 9，表明模型拟合程度较好，可以用此模型分析和预测枯草芽孢杆菌发酵制备金针菇抗氧化肽的工艺条件，A、D、BC、BD、CD、A2、B2、C2、D2对金针菇抗氧化肽ABTS自由基清除率的影响极显著（P0.001），B、AB、AC、AD的影响较显著（P0.01），C对金针菇抗氧化肽ABTS自由基清除率影响显著（P0.05）。根据F值判断各因素对金针菇抗氧化肽ABTS自由基清除率影响排序为：DABC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.T004表4方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型98.44147.0342.340.000 1***A3.7713.7722.730.000 3***B2.7012.7016.250.001 2**C1.3211.327.950.013 6*D5.9415.9435.750.000 1***AB2.4212.4214.560.001 9**AC2.6112.6115.710.001 4**AD2.5112.5115.130.001 6**BC3.1513.1518.970.000 7***BD9.3319.3356.210.000 1***CD8.7618.7652.760.000 1***A223.75123.75143.030.000 1***B226.69126.69160.740.000 1***C226.40126.40158.960.000 1***D26.0716.0736.550.000 1***残差2.32140.17失拟值1.06100.110.330.927 4纯误差1.2740.32总值100.7628注：“*”表示影响显著（P0.05），“**”表示影响较显著（P0.01），“***”表示影响极显著（P0.001）。各因素的交互作用对金针菇抗氧化肽ABTS自由基清除率的影响见图5~图10。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.F005图5液料比和发酵时间对金针菇抗氧化肽ABTS自由基清除率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.F006图6液料比和发酵温度对金针菇抗氧化肽ABTS自由基清除率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.F007图7液料比和金针菇用量对金针菇抗氧化肽ABTS自由基清除率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.F008图8发酵时间和发酵温度对金针菇抗氧化肽ABTS自由基清除率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.F009图9发酵时间和金针菇用量对金针菇抗氧化肽ABTS自由基清除率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.F010图10发酵温度和金针菇用量对金针菇抗氧化肽ABTS自由基清除率的影响由图5~图10可知，各曲面图中的等高线均为椭圆形，表明各因素间的交互作用对金针菇抗氧化肽ABTS自由基清除率具有显著影响，与方差分析结果相符。2.4验证试验结果由Design Expert 8.0.6软件预测此工艺的最优条件为液料比为4.51 mL/g、发酵时间30.40 h、发酵温度34.91 ℃、金针菇用量40.00 g。在此条件下预测金针菇抗氧肽的ABTS自由基的清除率为95.60%。为试验操作方便，将条件校正为液料比4.50 mL/g、发酵时间30 h、发酵温度35 ℃、金针菇用量40.00 g。为检验该预测条件的可靠性，进行3次验证试验，得到金针菇抗氧化肽的ABTS自由基清除率为96.75%。实测值与预测值相差很小，表明所建模型与实际情况高度拟合，此响应面法优化的枯草芽孢杆菌发酵制备金针菇抗氧肽的工艺可靠。2.53个分子量区间内抗氧化肽的ABTS自由基清除率结果（见表5）由表5可知，肽分子量越小，ABTS自由基清除率越高；截留分子量小于3 kD的金针菇抗氧化肽的抗氧化性最强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.020.T005表53个分子量区间内抗氧化肽的ABTS自由基清除率结果项目小于3 kD3~10 kD大于10 kDABTS自由基清除率97.8492.5788.23%3结论本试验结果表明，枯草芽孢杆菌为最适发酵菌种，pH值沉淀法分离抗氧肽的最适pH值为6；最佳发酵条件为液料比4.50 mL/g、发酵时间30 h、发酵温度35 ℃，金针菇用量为40.00 g，此条件下得到金针菇抗氧肽对ABTS自由基清除率为96.75%；截留分子量小于3 kD的金针菇抗氧肽抗氧化性最强。