热应激是影响动物生产的重要因素[1]，可造成畜禽生长速度下降[2]、繁殖性能减弱[3]、畜禽产品品质下降[4]，严重时可以危及动物健康，对养殖经济效益具有较大的负面作用。尽管目前规模化、现代化养殖场的硬件设施有较大的改善，已能够有效减少热应激对畜禽的危害[5]，但我国小规模养殖场仍占较大比例，其硬件设施亟待提高，因而夏季高温对畜禽造成的热应激不容忽视。薄荷属于辛凉性发汗解热的传统中药，多用于感冒、目赤、头疼、身热等症状[6-7]，薄荷及其粗提物属于《饲料原料目录》中规定可用于饲料生产的饲料原料。热应激条件下断奶仔猪会出现采食量下降、身型消瘦、体毛粗乱及免疫力下降的现象，并对成活率造成负面影响[8]。有研究发现，在日粮中添加薄荷可以改善热应激条件下肉鸡的生长性能，对其血清免疫及代谢指标也具有显著的改善作用[9]。但目前薄荷及其提取物在生猪的应用中仍缺乏系统的研究，本试验在断奶仔猪日粮中添加薄荷提取物，观察其对断奶仔猪生长性能、血清生化指标的影响，为减少热应激对畜禽的危害提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验动物为约23日龄、体重约7.1 kg、公母各半且健康的“杜×长×大”三元商品猪，总计240头，由浙江东源养猪专业合作社提供。薄荷购自本地中药材市场，参考赵雨晴等[10]的研究方法使用水蒸气蒸馏法提取薄荷精油，具体工艺参数为：液料比11 mL/g、提取3.0 h、浸泡2.0 h、超声30 min。由于薄荷提取物挥发性与活性较强，不适合直接加入动物饲料，需要进行包埋处理，因此，参考陈燕等[11]的方法以β-环状糊精为主要材料对精油包埋以制成薄荷精提取物微囊，具体工艺参数为：β-环状糊精与薄荷精油的质量比为8∶1，温度40 ℃，搅拌时间2 h。薄荷提取物中L-薄荷醇含量约为5.58%，L-薄荷酮含量约为0.03%。1.2试验日粮仔猪基础日粮根据《猪饲养标准》（NY/T 65—2004）制定，基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.006.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米65.00消化能/(MJ/kg)13.48豆粕18.00粗蛋白/%18.86鱼粉4.50赖氨酸/%1.42椰子油粉1.50蛋氨酸/%0.46棕榈油粉0.50钙/%0.83豆油0.50磷/%0.59膳食纤维1.00麸皮5.50食盐0.35L-赖氨酸0.35DL-蛋氨酸0.30石粉0.40磷酸氢钙1.00甜菊糖苷（30%）0.10预混料1.00注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 1 500 IU、VD3 200 IU、VE 20 IU、VK3 3.55 mg、VB2 3.2 mg、VB6 1.5 mg、烟酰胺1.2 mg、泛酸钙10.2 mg、生物素0.5 mg、Cu 5.5 mg、Fe 100 mg、Zn 60 mg、Mn 6.7 mg、I 0.25 mg、Se 0.3 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。3.甜菊糖苷用于提高饲料甜度，以减少薄荷提取物对饲料适口性的负面影响。1.3试验设计选取240头断奶仔猪，随机分为4组，分别饲养于4栋不同保育舍，每组6个重复，每个重复10头仔猪。空白对照组（NC组）仔猪饲喂基础日粮，猪舍温度为（25±1）℃；阳性对照组（AC组）仔猪饲喂基础日粮，猪舍温度（33±1）℃；治疗1组（T50组）仔猪饲喂基础日粮+50 mg/kg薄荷提取物，猪舍温度（33±1）℃；治疗2组（T100组）仔猪饲喂基础日粮+100 mg/kg薄荷提取物，猪舍温度（33±1）℃。温度控制主要利用猪舍内部的风机、水帘及保温灯等设备。预试期3 d，正式试验期30 d。1.4饲养管理试验期间仔猪自由采食饮水，每天7：00记录前1 d的采食量，试验人员每2 h观察温度、采食及健康状况，并详细记录。仔猪免疫、保健及治疗按照场内规章制度执行。1.5测定指标及方法1.5.1生长性能试验结束时，提前12 h禁食，仔猪空腹称重，以重复为单位统计体重、采食量、死亡数及腹泻情况，计算平均日增重、平均日采食量、成活率、腹泻率及料重比。平均日增重=试验期增重/(试验天数×试验动物数)(1)平均日采食量=试验期总采总食量/(试验天数×试验动物数)(2)腹泻率=试验猪累计腹泻次数/(试验仔猪数×试验天数)×100%(3)成活率=(试验动物总数-试验动物死亡数)/试验动物总数(4)料重比=试验期间采食量/试验期增重(5)1.5.2血清指标各重复随机选择1头仔猪，前腔静脉采血5 mL，静置10 min，3 500 r/min离心10 min取上清液，-20 ℃冰箱中保存。1.5.2.1血清抗氧化指标测定的抗氧化指标包括：总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA），均使用Abcam上海贸易有限公司ELISA试剂盒进行检测。1.5.2.2血清免疫指标测定的免疫指标包括：免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白A（IgA）、补体C3、补体C4、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6），均使用Abcam上海贸易有限公司ELISA试剂盒进行检测。1.5.3炎症和热应激相关基因的表达量各重复随机选择1头仔猪进行屠宰，解剖获取背最长肌约5 g，置于液氮罐中。根据Trizol法获取背最长肌样品中的总mRNA，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，按照顺序加入目标基因引物和Taq聚合酶，在Bio-Rad CFX Manager real-time PCR仪（Bio-Rad公司）中进行实时荧光定量分析（qPCR），qPCR具体操作步骤参考试剂盒（Takara）说明书。qPCR结果以Pfaffl法进行统计。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。内参基因与目标基因信息见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.006.T002表2内参基因与目标基因信息基因引物序列（5'→3'）产物长度/bp退火温度/℃β-actin（内参）F：CGGCAACGAGCGGTTCAGGTR：GGGTACATGGTGGTGCCGCC17158TNF-αF：CCTTCCACCAACGTTTTCCTCR：AGTCGATCATCCTTCTCCAGC18853IL-6F：CTCTCCAGCCAGTCTTCATTGR：GTGTCCTAACGCTCATACTTT14053NF-κBF：TCCAACACCGCATAAACCR：TAAAGCTCACCCGCAACG24053HSP70F：CCAGACTTTCACCTACTTATTCAR：CCTTGTCATTGGTGATAGT24859注：引物使用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中Primer-Blast模块进行设计，参考基因组为Sus scrofa 11.1。1.6数据统计与分析试验数据采用Excel软件进行初步整理，SPSS 24软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1薄荷提取物对断奶仔猪生长性能的影响（见表3）由表3可知，NC组试验猪各指标均最优。与AC组相比，T50组和T100组仔猪末重和平均日增重显著提升（P0.05），腹泻率、料重比显著下降（P0.05）；且T100组仔猪与NC组差异不显著(P0.05)。AC组仔猪平均日采食量显著低于其他组（P0.05）。各组仔猪的成活率差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.006.T003表3薄荷提取物对断奶仔猪生长性能的影响组别初重/kg末重/kg平均日增重/[g/(头·d)]平均日采食量/[g/(头·d)]腹泻率/%成活率/%料重比NC组7.52±0.1817.38±0.85a328.57±10.61a568.43±20.54a1.03±0.23c100.001.73±0.05cAC组7.50±0.1114.88±0.53c246.05±14.87c494.56±16.37b4.86±0.84a98.332.01±0.06aT50组7.51±0.1516.16±0.61b288.37±12.55b539.25±19.60a2.12±0.35b100.001.87±0.04bT100组7.51±0.1617.16±0.82ab321.62±10.32a566.05±25.21a1.07±0.42c100.001.76±0.05c注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4、表6与此同。2.2薄荷提取物对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，NC组仔猪血清抗氧化性能最强。T50组和T100组仔猪血清T-AOC、CAT、GSH-Px、SOD活性显著高于NC组（P0.05）。T100组仔猪血清中MDA含量显著高于NC组（P0.05），显著低于AC组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.006.T004表4薄荷提取物对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响组别T-AOC/(U/mL)CAT/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)SOD/(U/mL)MDA/(μmol/L)NC组4.46±0.28a14.63±0.97a456.39±28.49a126.57±10.86a3.36±0.35cAC组2.98±0.39c9.76±1.13c272.61±23.81c60.49±7.48c5.68±0.52aT50组3.61±0.25b11.59±0.86b367.68±19.35b83.88±9.65b5.47±0.48abT100组4.27±0.34a13.67±1.20a435.42±20.17a115.20±12.71a4.64±0.36b2.3薄荷提取物对断奶仔猪血清免疫指标的影响（见表5）由表5可知，T100组仔猪血清IgG含量与NC组差异不显著（P0.05）。AC组仔猪血清中TNF-α和IL-6含量显著高于其他组（P0.05），T50组和T100组仔猪血清TNF-α和IL-6含量显著低于AC组（P0.05），T100组仔猪血清TNF-α和IL-6含量已达到未发生热应激时的水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.006.T005表5薄荷提取物对断奶仔猪血清免疫指标的影响项目NC组AC组T50组T100组IgG/(g/L)8.12±1.63a2.38±0.67c5.81±1.23b7.69±1.47abIgA/(g/L)2.84±0.34a1.69±0.27b2.52±0.41a2.65±0.62aIgM/(g/L)1.65±0.141.50±0.171.58±0.161.59±0.21补体C3/(g/L)0.52±0.07a0.28±0.06b0.43±0.09a0.48±0.06a补体C4/(g/L)0.052±0.0110.046±0.0090.045±0.0130.053±0.013TNF-α/(ng/L)163.25±15.43c258.46±17.56a217.61±14.39b174.21±18.71cIL-2/(ng/L)142.34±11.49128.46±13.64135.81±15.03133.59±13.88IL-6/(ng/L)42.57±±3.98b58.72±5.60a43.67±4.21b40.28±3.57b注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.4薄荷提取物对断奶仔猪炎症和应激相关基因表达的影响（见表6）由表6可知，NC组、T50组和T100组仔猪背最长肌NF-κB基因表达量显著低于AC组（P0.05）。NC组仔猪TNF-α基因表达量为各组最低，AC组最高，但随着日粮中薄荷提取物添加量提高，仔猪TNF-α基因表达量显著下降（P0.05）。AC组和NC组仔猪HSP70基因表达量显著低于T100组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.006.T006表6薄荷提取物对断奶仔猪炎症和应激相关基因表达的影响组别NF-κBTNF-αHSP70IL-6NC组1.387±0.020b0.957±0.060c0.653±0.010c1.283±0.110bAC组2.680±0.160a3.273±0.390a0.860±0.080bc2.607±0.410aT50组1.407±0.120b2.463±0.170b0.947±0.070ab1.447±0.250bT100组1.327±0.040b1.003±0.040c1.150±0.090a1.247±0.080b3讨论3.1薄荷提取物对热应激下断奶仔猪生长性能的影响邢帅兵[12]的研究以平均日采食量和平均日增重下降热应激标识，发现断奶仔猪（7~14 kg）的上限温度临界值为30.0~30.6 ℃；以脾和胸腺等器官发育为热应激标识，上限温度临界值为34.8~35.2 ℃。因此，本研究将NC组温度控制在（25±1）℃范围内，为避免影响仔猪后续发育，使用（33±1）℃环境温度进行试验。本研究结果显示，AC组仔猪的平均日采食量和平均日增重显著低于NC组，表明AC组仔猪在（33±1）℃环境已具有热应激症状；而高温环境下，T50组和T100组仔猪平均日采食量和平均日增重显著上升，表明薄荷提取物能够显著改善热应激对仔猪生长性能造成的负面效应。薄荷属于改善动物中暑症状的常规中药[13]，尽管薄荷提取物用于饲料生产的报道相对偏少，但现有资料认为其用于改善热应激条件下畜禽生产性能具有较高的可行性。宫汝淳等[14]研究发现，与对照组相比，200、400 mg/kg薄荷提取物组蛋鸡的产蛋率和日均采食量显著升高，破软蛋率、料蛋比和死淘率均显著降低，表明日粮中添加薄荷提取物可以显著降低热应激对蛋鸡生产性能造成的负面影响。张永青[15]在育肥猪基础日粮中添加0、6.25、12.50、25.00、50.00 mg/kg水平的薄荷提取物，结果表明，6.25 mg/kg的薄荷提取物对育肥猪的采食量无显著影响，但12.5 mg/kg组、25.0 mg/kg组和50.0 mg/kg组育肥猪的采食量分别比对照组下降11.96%、15.03%和9.00%，12.5 mg/kg组育肥猪料重比显著比对照组下降4.81%。而丁升艳等[16]在育肥猪日粮中分别添加0、12.5、25.0、50.0、100.0 mg/kg薄荷提取物，猪舍内平均温度27.9~32.4 ℃，发现试验组猪平均日增重、平均日采食量比对照组均略有下降，料重比高于对照组，但仅12.5 mg/kg组和100.0 mg/kg组与对照组存在显著差异；在试验前3周内，薄荷提取物添加组的采食量均较对照组下降，但试验最后3周育肥猪的生产性能总体高于前3周。关于薄荷提取物改善生产性能的报道结论存在较大的分歧，本研究认为，100 mg/kg添加水平可使热应激条件下断奶仔猪生长性能与未发生热应激仔猪接近，与上述研究结论不一致，可能是由于断奶仔猪日粮添加了更多香味剂和甜味剂，也可能是随着饲料研究和生产不断发展，猪日粮的配方更适于猪的生长需要。3.2薄荷提取物对热应激下断奶仔猪血清抗氧化能力的影响断奶仔猪在生长发育与代谢过程中会产生游离氧和羟基自由基等物质，对机体会造成不同程度的损伤，严重时影响机体健康，而在热应激条件下，动物机体抗氧化能力会出现明显下降[12]。体外抗氧化研究表明，薄荷醇提物、薄荷水提物对DPPH自由基清除的半效应浓度（EC50）为70.42、75.77 mg/L，两种提取物对ABTS自由基的EC50为9.04、18.03 mg/L，表明其具有较强的抗氧化效果[17]。宫汝淳等[14]研究认为，薄荷提取物可以显著提高鸡血清T-AOC、GSH-Px、SOD活性，显著降低MDA含量。王兰[18]在肉鸡日粮中添加200 mg/kg薄荷提取物后发现，肉鸡血清中SOD活性显著提升。本研究结果表明，热应激会导致断奶仔猪血清抗氧化能力下降，但在日粮中添加薄荷提取物可以显著提高血清抗氧化水平，添加量达到100 mg/kg时可以使猪血清抗氧化水平趋于正常。目前，关于薄荷提取物对猪血清抗氧化指标影响的报道偏少，需要进一步研究。3.3薄荷提取物对热应激下断奶仔猪血清免疫指标的影响血清中免疫球蛋白具有隔离病原和激活补体的功能，补体C3和C4属于不耐热的球蛋白，免疫球蛋白和补体含量是衡量机体免疫性能的重要标志[19]，长时间热应激会造成上述物质在动物血清中的含量下降，进而对机体健康造成负面作用[20-21]。王兰[18]研究发现，日粮中添加200 mg/kg薄荷提取物可提高肉鸡血清IgG含量。袁文军[22]配制了以薄荷为主的中药复方制剂，分别以0.5%、1.0%和1.5%比例添加至基础日粮中，以基础日粮中添加抗生素为对照组，发现薄荷复方制剂可以显著提高猪采食量、平均日增重，降低料重比；与对照组相比，0.5%、1.0%、1.5%组猪血清IgA含量分别提高3.37%、29.21%、32.58%，IgG含量分别提高12.99%、15.32%、18.44%，IgM含量分别提高19.64%、19.64%、26.79%，C3含量分别提高16.67%、16.67%、25.00%，C4含量分别提高了100%、120%、120%，与本研究基本一致。TNF-α、IL-6属于促炎因子；IL-2通过STAT5信号通路抑制Th17细胞分化使IL-17合成降低，进而使体内炎症得到抑制[23]。本研究结果表明，薄荷提取物可显著降低热应激条件下仔猪血清中促炎因子的含量，对IL-2含量无显著影响，但目前暂无类似的报道，需要进一步研究。3.4薄荷提取物对断奶仔猪热应激下炎症和热应激相关基因表达的影响动物长期处于热应激状态下会伴随体内炎症与过氧化反应，进而造成动物健康水平下降[24]，这一过程伴随相关基因的差异表达和蛋白差异合成。TNF-α参与Th17信号通路，与树突状细胞和组织细胞互作形成IL-23；IL-23参与初始T细胞分化成Th17细胞的过程，之后Th17细胞分泌IL-6等促炎因子，引发体内炎症[25]。正常条件下NF-κB（核因子激活的B细胞的κ-轻链增强）与IκB连接后，在细胞液中以无活性形式存在并分布于所有细胞。当出现应激或疾病等因素，IκB激酶会被激活，并在特异性的N端丝氨酸残基部位激活IkBα/β磷酸化，使IκB多聚二硝基化，致使其被26s蛋白酶体降解，促使胞质中无活性的NF-κB得以转到细胞核中，并与相关靶基因序列中启动子区域的κB序列结合而发生炎症[26]。热休克蛋白（HSP）是动物处于高温条件下受环境温度诱导产生的一类热应激蛋白，可以提高细胞耐热性[27]。但有研究认为，HSP70的基因表达量受到机体内HSP蛋白含量的负反馈调节[28]。马丹丹[29]在研究薄荷提取物对热应激条件下肉鸡免疫性能影响的分子机制时发现，热应激显著增加了脾脏主要模式识别受体TLR2、TLR4和MDA5、NF-κB和MAPK通路中转录因子的mRNA表达量和炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，但添加薄荷提取物后显著降低了主要模式识别受体NOD1和DAI，NF-κB和MAPK通路中转录因子的mRNA表达量和促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。尽管研究对象不同，本研究结果与上述研究基本一致。本研究结果显示，添加薄荷提取物有助于提高热应激条件下断奶仔猪HSP70基因表达量。4结论本研究表明，薄荷提取物可以改善热应激条件下断奶仔猪生长性能，提高血清抗氧化和免疫性能，对炎症和热应激相关基因表达量具有显著影响。综合研究结果，热应激条件下仔猪日粮中薄荷提取物的适宜添加量为100 mg/kg。