随着畜牧业迅速发展，我国农业的生产水平得到改善[1-2]。饲草对促进养殖业结构调整、发展现代农业战略具有重要作用[3]。2014年西藏地区草原普查数据显示，西藏天然草地面积867 hm2，约占我国草原总面积的22%，可利用草场年均产鲜草7 791万t[4]。因西藏自然环境特殊，畜牧业发展受饲草料短缺的限制[5]，开发非常规饲草是解决该地区畜牧业可持续发展的有效途径之一。玉米是世界上总产量最高的农作物[6]，在西藏地区的林芝市、昌都等地均有种植[7]。紫花苜蓿是优质豆科牧草之一，发展苜蓿种植产业对提高畜禽生长性能具有良好的促进作用[8]。近年来，紫花苜蓿在西藏地区的种植面积不断扩大，但利用方法有限，主要是制作干草和制备青贮。青贮饲料通过酵母菌发酵生成以乳酸为主的有机酸，进而降低pH值，抑制腐败微生物活性，减少养分流失[9]。研究发现，牧草制备干草约有25%的营养损失，而制备青贮饲料仅有3%~10%的营养损失[10]。青贮饲料质地柔然，具有独特酸香味，能够促进采食[11]，优质的青贮饲料还能够缓解家畜饲料供需矛盾。本试验以种植于西藏农牧学院草业实习基地内的全株玉米和紫花苜蓿为研究对象，探讨在常规青贮条件下，全株玉米与紫花苜蓿混合青贮的适宜比例，为西藏地区青贮饲料的加工生产提供参考。1材料与方法1.1试验材料紫花苜蓿品种为WL168HQ，全株玉米品种为利合228，由西藏农牧学院草业实验室提供，种植于林芝市巴宜区西藏农牧学院草业实习基地。紫花苜蓿为盛花期，玉米为乳熟末期，统一进行收割（收获时间为2021年7月），将紫花苜蓿和全株玉米粉碎至1~2 cm。1.2试验设计及青贮制备试验设置6组，A组、B组、C组为正常混合组，玉米和苜蓿的比例分别为2∶1、1∶1、1∶2；FA组、FB组、FC组为混合青贮组，玉米和苜蓿的比例分别为2∶1、1∶1、1∶2，每个处理3个重复，各混合青贮组按比例混匀，填入容器约为1 L的塑料广口瓶内（高12.7 cm，壁厚0.25 cm，直径10 cm），使用干净的木棍压实，每个比例3个塑料广口瓶。塑料瓶中装满原料，进行严格密封，防止空气进入，室温置于阴凉避光处密封保存60 d。1.3测定指标及方法1.3.1感官评定采用德国农业协会对青贮饲料感官评定标准及等级评定法[12]，对青贮饲料的色泽、质地、气味按照标准进行评分，感官评定等级分为4个：优良（16~20分）、尚可（10~15分）、一般（5~9分）、腐败（0~4分）。1.3.2营养成分及发酵品质打开广口瓶，弃去瓶内超过3 cm上方的青贮饲料，剩余青贮料取出并混合均匀，称取70 g青贮饲料置于300 mL锥形瓶，加入140 g去离子水，4 ℃浸提24 h，漏斗过滤，收集滤液测定pH值和氨态氮含量。剩余青贮饲料收集烘干，《饲料分析及饲料质量检测技术》[13]测定粗蛋白质（CP）、粗脂肪（EE）、粗灰分（Ash）含量，粗纤维（CF）参照Soest等的方法[14]采用ANKOM A2000半自动纤维分析仪测定。pH值采用精密pH计测定，氨态氮含量采用DB15/T 1458—2018[15]方法测定。1.3.3微生物序列分析各组新鲜原料和青贮后的样品进行总DNA的提取，利用前引物（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和后引物（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）获得细菌的高变异区，制备测序文库，使用MiSeq测序仪进行测序，利用UCLUST比对工具对操作分类单元（OTU）进行归并和划分，对OTU进行分类地位的鉴定[7]。使用QIIME2软件进行各分类水平的分类学组成分析。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 21.0软件进行方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同比例玉米和苜蓿混合青贮的感官评定结果（见表1）由表1可知，FA组、FB组青贮饲料的感官评分为优良，FC组青贮饲料的感官评分为尚可。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.022.T001表1不同比例玉米和苜蓿混合青贮的感官评定结果组别色泽气味质地综合分数等级FA组212418优良FB组211316优良FC组210214尚可2.2不同比例玉米和苜蓿对青贮饲料营养成分的影响（见表2）由表2可知，FB组、FC组青贮饲料的CP含量显著高于FA组（P0.05），各混合比例青贮后饲料的CP含量均低于青贮前（P0.05）。各组EE含量随全株玉米比例降低而降低，A组饲料的EE含量最高，各混合比例青贮后饲料的EE含量均低于青贮前。饲料中CF含量随着紫花苜蓿含量升高而升高，C组饲料CF含量显著高于A组（P0.05），FA组青贮饲料的CF含量显著低于FC组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.022.T002表2不同比例玉米和苜蓿对青贮饲料营养成分的影响（风干基础）组别CPEECFAshA组8.77±0.12b2.59±0.30bc27.17±1.26a6.37±0.76B组10.89±0.13d2.14±0.51bc33.20±1.05bc7.87±1.53C组13.28±0.07f2.21±0.63bc35.31±1.02cd8.09±2.64FA组7.95±0.11a1.84±0.35a30.22±2.12ab7.15±3.41FB组9.96±0.08c1.82±0.32ab31.71±2.69bc6.37±0.76FC组12.12±0.13e1.52±0.26a38.63±3.44cd7.54±1.84注：同列数据不同肩标字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表3与此同。%2.3不同比例玉米和苜蓿对青贮饲料发酵品质的影响（见表3）由表3可知，各组青贮饲料的pH值均小于4.2大于4.0，随着全株玉米添加水平提高，青贮饲料的pH值减小，FC组的pH值显著高于FA组、FB组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.022.T003表3不同玉米和苜蓿比例对青贮饲料发酵品质的影响组别pH值氨态氮/(mg/L)FA组4.01±0.01a48.41±1.48aFB组4.03±0.32a57.47±1.47bFC组4.11±0.04b68.28±1.79c氨态氮反映了青贮原料中蛋白质和氨基酸的降解程度。青贮饲料发酵时部分的氨基酸和蛋白质会被一些不良微生物分解成氨、硫化氢和胺类[16]，蛋白质和氨基酸降解率增大[17]，氨态氮含量增加[18]。由表3可知，FC组青贮饲料氨态氮含量显著高于FA组和FB组（P0.05），FB组青贮饲料的氨态氮显著高于FA组（P0.05)。2.4不同比例玉米和苜蓿青贮饲料微生物多样性分析结果2.4.1不同比例玉米和苜蓿青贮饲料的物种组成分析结果（见表4）通过高通量测序技术对处理的16S基因全长测序，共鉴定出22个门、46个纲、115个目、224个科、643个属，其中A组共分出16个门、29个纲、72个目、131个科、279个属，B组共分出13个门、22个纲、55个目、95个科、193个属，C组共分出14个门、23个纲、55个目、96个科、205个属，FA组共分出15个门、31个纲、73个目、97个科、339个属，FB组共分为16个门、24个纲、57个目、144个科、173个属，FC组共分为18个门、34个纲、76个目、134个科、300个属。将相对丰度排名Top5的细菌类群进行汇总与显著性统计。由表4可知，在门水平上，未青贮组蓝藻菌门（Cyanobacteria）显著高于青贮组（P0.05），未青贮组厚壁菌门（Firmicutes）显著低于青贮组（P0.05）。在纲水平上，未青贮组氧发光菌纲（Oxyphotobacteria）显著高于青贮组（P0.05），芽孢杆菌纲（Bacilli）显著低于青贮组（P0.05）。在目水平上，未青贮组叶绿体菌目（Chloroplast）显著高于青贮组（P0.05），乳酸杆菌目（Lactobacillales）显著低于青贮组（P0.05）；A组的根瘤菌目（Rhizobiales）显著高于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.022.T004表4不同比例玉米和苜蓿青贮饲料的物种组成分析结果项目A组B组C组FA组FB组FC组门水平蓝藻菌门84.71±17.51b91.73±8.83b89.20±16.79b1.39±0.95a0.99±0.23a3.90±0.59a厚壁菌门0.22±0.13a0.23±0.14a0.59±0.06a85.40±11.69b96.04±2.31c86.14±10.67b变形菌门8.94±0.326.37±0.706.45±0.584.99±1.312.24±1.635.08±0.27纲水平氧发光菌纲84.71±17.52b91.73±8.83b89.20±16.79b0.52±0.20a0.45±0.24a0.63±0.13a芽孢杆菌纲0.21±0.12a0.16±0.08a0.19±0.12a93.20±3.87b91.28±9.89b89.13±10.92bα-变形菌纲1.70±0.513.15±0.790.67±0.082.92±2.781.59±1.121.10±0.63目水平叶绿体菌目84.70±17.52b91.73±8.83b96.66±3.83b0.52±0.19a0.45±0.24a1.48±1.20a乳酸杆菌目0.11±0.04a0.15±0.07a0.30±0.17a88.10±10.16bc95.69±2.43c84.01±11.66b根瘤菌目5.93±3.80b0.65±0.47a0.15±0.02a2.25±2.11a0.65±0.45a2.81±1.90a科水平叶绿体菌科84.70±17.52b91.73±8.83b89.20±16.79b0.52±0.20a0.45±0.24a0.63±0.13a乳杆菌科0.06±0.01a0.09±0.06a0.19±0.17a50.00±20.04b56.76±15.84b51.13±1.69b明串珠菌科0.04±0.03a0.05±0.04a0.05±0.03a28.91±6.96bc37.56±13.93c20.14±9.04b属水平叶绿体菌属84.70±17.52b91.73±8.83b89.20±16.79b1.38±0.19a0.45±0.23a3.86±6.46a乳酸杆菌属0.06±0.01a0.89±0.58a1.68±0.16a50.00±20.05b56.75±15.84b57.34±13.98b魏斯氏菌属0.30±0.03a0.04±0.03a0.03±0.02a15.02±1.66b31.37±14.06c11.72±3.07b注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。在科水平上，未青贮组叶绿体菌科（Chloroplast）水平显著高于青贮组（P0.05），乳杆菌科（Lactobacillaceae）水平显著低于青贮组（P0.05）。在属水平上，未青贮组叶绿体菌属（Chloroplast）水平显著高于青贮组（P0.05），而乳酸杆菌属（Lactobacillus）显著低于青贮组（P0.05）。2.4.2不同比例玉米和苜蓿青贮饲料的微生物α多样性分析结果（见表5）Coverage指数表示不同处理组中微生物α多样性的覆盖度。由表5可知，不同处理组Coverage指数均大于0.997，表明测序基本达到覆盖样品中所有微生物。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.022.T005表5不同比例玉米和苜蓿青贮饲料的微生物α多样性分析结果项目A组B组C组FA组FB组FC组Coverage0.9970.9970.9980.9970.9990.997Chao1 指数696±220a471±354a351±219a680±373a310±38a542±250aObserved species指数578±309a377±277a285±175a604±338a276±33a474±230aShannon指数2.66±1.88a1.45±1.07a1.96±0.88a4.52±1.04bc4.30±0.20bc4.18±0.98bcSimpson指数0.49±0.32ab0.25±0.18a0.40±0.41ab0.85±0.09c0.71±0.03bc0.83±0.06cα多样性常用分析指标主要有群落物种丰富度和多样性的分析，群落物种多样性程度常用Shannon和Simpson指数表示，群落物种丰富度以Chao1和Observed species指数表示[19]。由表5可知，未青贮组饲料的Shannon指数显著低于青贮组（P0.05），表明青贮前饲料的微生物多样性低于青贮后，即青贮过程中增加了饲料中微生物的丰富度。饲料样品中物种的丰富度和测试数据的合理性采用稀释曲线进行检测。不同比例玉米和紫花苜蓿青贮前后稀释曲线见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.022.F001图1不同比例玉米和苜蓿青贮前后稀释曲线由图1可知，随着测序深度的增加，稀释曲线基本达到平缓，表明本次测序的结果具有合理性。2.4.3不同比例玉米和苜蓿青贮前后PCoA分析结果（见图2）使用主成分分析法对样品进行分析，图中的圆点距离越近，代表样品之间微生物群落相似度越高。由图2可知，青贮前各组细菌菌群相对离散，表明青贮前各比例之间细菌菌落组成差异显著；混合青贮后各组间距离比青贮前小，表明青贮后各组之间的细菌群落差异性变小。青贮后各处理组各点之间的距离相对缩小，表明青贮后各组饲料组内的细菌群落差异性变小，PC1轴和PC2轴对结果的解释度分别为53.1%和19.1%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.022.F002图2不同比例玉米和苜蓿青贮前后PCoA分析结果2.4.4不同比例玉米和苜蓿青贮前后Venn图（见图3）由图3可知，6组有80个共有OTUs，A组有1 807个独有OTUs，B组有735个独有OTUs，C组有465个独有OTUs，D组有1 403个独有OTUs，E组有381个独有OTUs，F组有953个独有OTUs。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.022.F003图3不同比例玉米和苜蓿青贮前后Venn图3讨论3.1不同比例玉米和苜蓿对青贮饲料感官评定的影响本试验发现，玉米和紫花苜蓿混合比例为2∶1组和1∶1组青贮的等级评定结果为优良，1∶2组为尚可，随着全株玉米占比增加，评分呈上升趋势。研究表明，紫花苜蓿单独青贮评分均较低[20]。本试验中，在紫花苜蓿中加入一定比例的全株玉米可提升青贮饲料的感官评定等级，与胡远彬等[21]、李权[22]研究结果一致。3.2不同比例玉米和苜蓿对青贮饲料营养成分的影响研究表明，全株玉米与甘蔗梢混合青贮[23]、荞麦与玉米混合青贮[24]等可改善饲料品质。本试验发现，随着紫花苜蓿比例提高，饲料中CP含量升高，原因可能与紫花苜蓿蛋白含量高于全株玉米有关。李龙兴等[25]探究不同比例紫花苜蓿与玉米秸秆的混合青贮对发酵品质的影响，发现CP含量随着玉米秸秆添加量增加而降低，与本试验结果类似。EE含量可在一定程度上影响饲料的品质。本试验发现，随着全株玉米比例降低，EE的含量也随之降低，与李雅斐[20]发现全株玉米和紫花苜蓿混合青贮时当紫花苜蓿含量较多时，EE含量呈现下降趋势的结果一致，表明紫花苜蓿比例的增加会减少青贮料中EE含量。CF在动物体内具有促进肠道发育的作用[26]，但过高的CF影响动物体对其他营养物质的吸收。本试验发现，随着紫花苜蓿含量升高，饲料中CF含量升高，且A组CF含量低于B组和C组，FC组CF含量显著低于FA组，表明进行混合青贮时加入过多的紫花苜蓿会降低饲料的品质，不利于饲料的消化吸收。3.3不同比例玉米和苜蓿对青贮饲料发酵品质的影响pH值低于4.2的青贮饲料归类为优质等级[27]。本试验发现，不同比例玉米和苜蓿混合青贮饲料的pH值均低于4.2，表明混合青贮的pH值均达到优质水平。随着玉米添加水平提高，青贮饲料pH值减少，且玉米∶苜蓿比例为2∶1时青贮饲料的pH值低于其他两个组，可能与全株玉米中水溶性碳水化合物（WSS）含量较高有关。WSS是决定青贮饲料发酵品质的关键因素[28]，青贮饲料发酵过程中需要有较适宜的WSS进行厌氧发酵产生乳酸，降低pH值[29]。李雅斐[20]研究发现，青贮饲料pH值随着紫花苜蓿含量的增加而提高，与本试验结果一致。本试验中，青贮后氨态氮含量随紫花苜蓿含量的增加而增加，FC组青贮饲料的氨态氮含量显著高于其他两组，与辛鹏程等[4]结果接近，原因可能是紫花苜蓿添加水平提高，混合青贮饲料中蛋白质的含量升高，造成更多的蛋白质和氨基酸与不良的微生物接触使其分解。3.4不同比例玉米和苜蓿对青贮饲料微生物多样性分析青贮发酵的过程中会有一些革兰氏阴性菌跟乳酸菌竞争发酵底物，对青贮的发酵品质产生影响[30]。本试验结合α多样性、β多样性以及OTU统计分析，发现新鲜混合料中的优势菌门为蓝藻菌门，青贮饲料的优势菌门为厚壁菌门，与陶莲等[31]的结果一致。厚壁菌门能够有效地分解植物饲料中的粗纤维，从而提高饲料的适口性。本试验发现，玉米∶苜蓿比例为1∶1的厚壁菌门占比最高，表明该比例提高了原料中粗纤维的分解，从而促进发酵。本试验中，新鲜混合料中的优势菌属为蓝藻菌属；青贮后的优势菌属为乳杆菌属，且相对丰度提高随着紫花苜蓿添加水平提高而提高。从微生物多样性的角度综合分析，全株玉米和紫花苜蓿混合比例在1∶1时对青贮饲料中有益细菌的生长和繁殖较适宜，能够抑制有害菌，在青贮过程中能够较好地保存饲料原料中的营养物质。4结论西藏地区的全株玉米与紫花苜蓿混合青贮对饲料发酵品质和营养价值的提高均具有一定积极作用，能够抑制有害菌群在青贮过程的作用，提高青贮中有益菌群的活性。综合分析发现，全株玉米和紫花苜蓿混合比例为1∶1时，混合青贮饲料品质较好。