九节（Psychotria asiatica L.）为茜草科（Rubiaceae）九节属（Psychotria L.）植物，又名大丹叶、山大颜、山大刀等[1-2]，为我国野生植物资源，广泛分布于我国西南部至东部[3]。研究表明，九节成分复杂多样，含黄酮类、环烯醚萜类、鞘糖脂及苯并呋喃类等多种生物活性物质[4]。黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒等药理活性[5-6]，且九节中黄酮类化合物的含量较高。在动物日粮中添加适量九节黄酮中的染料木素能够显著促进机体脂质代谢进程，抑制畜禽脂肪沉积，有效提升肉品质。孟婷等[7]研究发现，染料木素对雄性肉鸭腹脂率、血清低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇含量均具有明显的抑制作用，能够显著提高肉鸭的瘦肉率及血清瘦素水平。研究表明，添加250 mg/kg槲皮素可有效调节肉鸡营养物质代谢，从而增加肉鸡的平均体重[8]。Zhou等[9]研究表明，添加200 mg/kg黄芩苷对肉鸡体增重和饲料转化率具有明显的改善作用。黄酮类化合物具有类雌激素双重调节作用，可通过调控动物雌激素分泌及代谢，提高蛋禽的产蛋量及蛋品质。Liu等[10]在蛋鸡基础日粮中添加0.4 g/kg槲皮素，发现蛋壳厚度、蛋壳强度及哈夫单位均显著改善，蛋黄胆固醇含量显著降低。Ting等[11]在白来航鸡基础日粮中增添适量九节黄酮中的橙皮素和柚皮素，发现蛋黄胆固醇含量显著降低，血清超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性显著提升。目前，九节属植物的研究仍然属于起步阶段，仅有少量文献报道九节属植物化学成分及生理活性研究结果，关于九节属植物的纯化工艺研究较少。本试验以总黄酮回收率为考察指标，采用大孔树脂纯化工艺[12]通过单因素试验筛选最佳单因素条件，并结合Box-Behnken响应面分析技术获得总黄酮最佳富集纯化工艺，为实现九节总黄酮在畜禽养殖中的综合利用提供参考。1材料与方法1.1仪器设备与材料RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司），蜀牛GG-17抽滤瓶、HH-S4数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司），UV-2600紫外分光光度仪（岛津企业管理（中国）有限公司）。芦丁标准品（批号100080-201811，中国食品药品检定研究院），乙醇（成都科隆化学品有限公司），氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司）、亚硝酸钠、硝酸铝（上海新宝精细化工厂），3种大孔吸附树脂（HP-20、AB-8、D101，天津市光复精细化工研究所）。九节采自广西玉林市龟山公园，完整、新鲜、无虫蛀，经鉴定为茜草科植物九节。1.2测定指标及方法1.2.1九节总黄酮的提取方法九节清洗后自然阴干，粉碎，精密称取20.0 g九节粉末置于500 mL锥形瓶中，以15 mL/g的液料比加入定量的乙醇提取剂，恒温60 ℃回流提取2次，每次1 h，合并滤液，旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，4 ℃保存。1.2.2供试品溶液的制备及总黄酮含量测定称取已制备的流浸膏适量，使用少量70%乙醇溶解，定容至50 mL容量瓶，作为供试品溶液。取1 mL供试品溶液置于10 mL容量瓶中，显色反应后于510 nm波长处测定吸光度，计算供试品黄酮含量。总黄酮含量=C×VC1×V1×100% (1)式中：C为根据回归方程求得的九节总黄酮含量（g/L）；V为定容后的黄酮体积（mL）；C1为总黄酮待测液的浓度（g/L）；V1为测定吸光度时所取总黄酮待测液体积（mL）。1.2.3大孔吸附树脂的预处理参照文献[13]方法预处理大孔吸附树脂，将不同类型的大孔吸附树脂分别置于各烧杯，70%乙醇浸泡24 h，充分膨胀，期间用玻璃棒不断搅拌去除气泡，真空泵抽滤至干，使用70%乙醇冲洗至流出液加等量纯水不再显白色浑浊，使用纯水冲洗大孔吸附树脂至无醇味，室温条件下放置。1.2.4大孔吸附树脂对九节黄酮的吸附-解吸附分析精密称取1.0 g粗提物总黄酮浸膏至烧杯，加入少量70%乙醇充分搅拌溶解，定容至250 mL容量瓶，作为样品溶液。将已经处理好的大孔吸附树脂抽滤至干，分别精密称取3.0 g各型号的大孔吸附树脂于250 mL具塞锥形瓶中，分别加入样品液100 mL，室温置于恒温振荡培养箱中振荡24 h，吸附平衡[14]，过滤后吸取一定量体积的滤液，根据公式（1）计算吸附后溶液的九节总黄酮含量。将吸附平衡后的树脂使用少量纯水洗去大孔吸附树脂表面杂质与溶液，抽滤至干，置于250 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，室温置于恒温振荡培养箱中振荡24 h，使其至解吸附平衡[15]，过滤后吸取一定量体积的滤液依法测定解吸附后溶液的九节总黄酮含量，计算吸附量、吸附率、解吸率和回收率。静态饱和吸附量=(C0-C1)×V1M (2)吸附率=C0-C1C0×100% (3)解吸率=C2×V2C0×V1-C1×V1×100% (4)回收率=C2×V2C0×V1×100% (5)式中：C0为吸附前样品溶液中总黄酮的初始含量（g/L）；C1为吸附平衡后溶液中总黄酮含量（g/L）；C2为解吸平衡后解析液中总黄酮含量（g/L）；V1为吸附液体积（mL）；V2为解析液体积（mL）；M为样品质量（g）。1.2.5单因素试验考察不同提取条件对九节总黄酮纯化率的影响，层析柱上样流速、洗脱剂流速均固定为2 g/L，考察对上样浓度（2、5、8、11 g/L）、上柱液pH值（2、4、6、8）、层析柱高径比（5∶1、7∶1、9∶1、11∶1）、乙醇浓度（50%、60%、70%、80%）对九节黄酮回收率的影响。1.2.6响应面因素水平设计设计原理为Box-Behnken中心组合，依据单因素试验结果选择对响应值有显著影响的因素，如选取上样浓度（A）、pH值（B）、高径比（C）、乙醇浓度（D）考察因素，借助Design-Expert 10.0.1统计软件通过逐步回归对试验数据进行回归拟合。响应面因素水平设计见表1，根据最终优选的纯化条件，进行验证试验[16]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.T001表1响应面因素水平设计水平A/(g/L)BCD/%-1336∶1550547∶1601758∶1652结果与分析2.1芦丁对照品标准曲线测定结果（见图1）参考文献[17]，以芦丁标准溶液的质量浓度（g/L）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。由图1可知，标准曲线的线性回归方程为y=11.98x-0.001 2，R2=0.999 9，表明芦丁标准品溶液在此范围内线性关系良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.F001图1芦丁对照品标准曲线2.2不同树脂对九节总黄酮吸附与解吸的影响（见表2）由表2可知，各树脂对九节总黄酮的吸附能力排序为HP-20AB-8D101，解吸能力排序为D101HP-20AB-8。依据“相似相吸”原则[18]，大部分黄酮类化合物分子极性偏小，因此非极性与弱极性树脂表现出较好的吸附效果，采用AB-8型大孔树脂分离纯化九节黄酮无明显优势。非极性树脂D101解吸率略高于HP-20、AB-8，但吸附率低。通过对3种不同树脂的静态吸附量、吸附率、洗脱率与回收率的综合比对，非极性树脂HP-20富集纯化性能较佳，因此选用HP-20树脂做后续研究。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.T002表2不同树脂对九节总黄酮的吸附与解吸的影响树脂型号极性吸附量/(mg/g)吸附率/%解吸率/%回收率/%HP-20非极性35.4770.8878.2285.58D101非极性34.8769.8180.7885.16AB-8弱极性35.1170.3177.8983.332.3单因素试验结果2.3.1上样浓度对九节总黄酮回收率的影响（见图2）精密称取浸膏适量制成不同浓度样液，取已预处理的HP-20大孔吸附树脂湿法装柱（2 cm×30 cm），固定上柱液pH值4，层析柱高径比7∶1，乙醇浓度60%，动态吸附后收集洗脱液测定总黄酮回收率。由图2可知，当上样溶液浓度较小时，回收率较低，随着上样溶液浓度增加，回收率不断增大，当上样液浓度由5 g/L升高至8 g/L后回收率提升趋势变缓慢，变化不明显。样液中总黄酮含量越高越易被吸附。在实际生产中，黄酮含量越高所含杂质相对越多，通过层析柱时大孔吸附树脂被杂质污染，而没有时间吸收或无法吸收，导致部分黄酮化合物损失，回收率下降，最终出现上样液浓度增加，回收率反而逐渐降低的现象。因此试验过程中选择上样液的最佳总黄酮浓度为5 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.F002图2上样液浓度对总黄酮回收率的影响2.3.2上柱液pH值对九节总黄酮回收率的影响（见图3）固定上柱液浓度5 g/L、层析柱高径比7∶1、乙醇浓度60%，考察不同pH值上样液对总黄酮回收率的影响。由图3可知，在pH值不断增大过程中，九节黄酮回收率表现为先增加后降低的趋势，且当pH值为4时，其回收率达到峰值。推测黄酮类化合物多数为多羟基酚类，其弱酸性特质导致其溶解度在酸性条件下降低，且在pH值为4时，黄酮类化合物呈分子状态，以氢键的方式存在，因此利于被树脂吸附。但当pH值改变时，因酸性过大或过小导致沉淀析出，影响回收率[19-21]。因此，选择pH值为4进行HP-20大孔树脂吸附九节总黄酮试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.F003图3上样液pH值对总黄酮回收率的影响2.3.3层析柱高径比对九节总黄酮回收率的影响（见图4）固定上柱液浓度5 g/L、上柱液pH值4、乙醇浓度60%，考察不同层析柱高径比对总黄酮回收率的影响。由图4可知，随着层析柱高径比的增大，回收率逐渐上升，回收效果也逐渐加强，但到达一定的高度回收效果变化不明显，由于吸附时间增加会造成树脂浪费，因此试验过程中选择树脂层析柱的高径比为7∶1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.F004图4层析柱高径比对总黄酮回收率的影响2.3.4乙醇浓度对九节总黄酮回收率的影响（见图5）固定上柱液浓度5 g/L、上柱液pH值4、层析柱高径比7∶1，吸附1 h后取不同体积分数乙醇作为洗脱剂，测定总黄酮回收率。由图5可知，随着乙醇浓度逐渐上升，解吸率显著提高，大孔吸附树脂对九节总黄酮的回收率较高。由于九节总黄酮中的糖苷键类化合物和一些多酚结构在溶液中极性较低，易被乙醇洗脱。洗脱液浓度过低致使洗脱不完全，而乙醇浓度过高，会将部分杂质一并洗脱出来。因此试验过程中选择乙醇的最佳体积分数为60%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.F005图5乙醇浓度对总黄酮回收率的影响2.4九节总黄酮纯化工艺优化结果2.4.1响应面试验结果（见表3）试验以4个影响因素为自变量，九节总黄酮回收率为因变量作为响应值，借助Design-Expert 10.0.1软件中心组合法，进行4因素3水平响应面试验。对试验中得到的数据进行二次多元回归拟合[22]。由表3可知，试验数据经Design-Expert 10.0.1软件回归拟合，得到九节黄酮回收率为目标函数二次回归方程：10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.T003表3响应面试验结果试验号A/(g/L)BCD/%九节黄酮回收率/%1547∶16087.92556∶16085.43346∶16085.54747∶15586.35558∶16084.26357∶16084.77757∶16084.48748∶16085.79548∶16585.210537∶16586.111348∶16084.612547∶16087.513546∶16586.114547∶16087.215557∶15585.316547∶16087.717536∶16085.318538∶16085.119547∶16087.420557∶16584.521747∶16585.922746∶16085.923546∶15585.624737∶16085.725347∶16585.626537∶15585.327337∶16084.728347∶15585.229548∶15585.8黄酮回收率Y=-155.681+4.093 75A+19.214 2B+18.400 8C+4.379 33D-0.162 5AB+0.087 5AC-0.02AD-0.25BC-0.08BD-0.055CD-0.270 625A2-1.52B2-1.057 5C2-0.0298D2。应用软件Design-Expert 10.0.1对试验的结果进行方差分析，方差分析结果见表4。模型的P值小于0.000 1，表示试验所用模型显著性高，方差的失拟项不显著（P=0.894 20.05），表明试验值与预测值吻合较好，模型适合使用。线性系数A、B、C、二次项系数A2、B2、C2、D2和交互项系数BC、CD均具有极显著影响（P0.01），交互项系数AB、BD均具有显著影响（P0.05），其他项系数均不显著（P0.05）。由F值可以看出各因素对九节总黄酮纯化的影响排序为：BACD。变异系数（CV）为0.24%较低，表明本试验精度和可靠性较高，回归模型的方程能够很好地反映出真实试验值，可以用该回归模型分析响应值变化趋势。模型相关系数R2=0.979 3，Rpred2为0.924 7和Radj2为0.958 7值接近1，表明模型真实值同预估值拟合度高，可以对九节总黄酮不同纯化条件下评价指标进行预测。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.T004表4方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值显著性模型27.480141.96047.420.000 1**A1.08011.08026.090.000 2**B1.14011.14027.560.000 1**C0.85010.85020.620.000 5**D8.333×10-418.333×10-40.0200.889 2AB0.42010.42010.210.006 5**AC0.12010.1202.960.107 4AD0.16010.1603.870.069 4BC0.25010.2506.040.027 6*BD0.64010.64015.460.001 5**CD0.30010.3007.310.017 1*A27.60017.600183.630.000 1**B214.990114.990362.050.000 1**C27.25017.250175.240.000 1**D23.60013.60086.980.000 1**残差0.580140.041失拟性0.290100.0290.390.894 2不显著纯误差0.29040.073总和28.06028注：“*”表示影响显著（P0.05），“**”表示影响极显著（P0.01）。2.4.2各因素交互作用对九节黄酮回收率的影响（见图6~图11）根据二次回归方程预测4个因素对九节黄酮回收率的三维响应曲面和等高线图影响。响应曲面坡度越陡峭，代表响应值随着实验因素的改变愈加敏感；相反，曲面越平缓代表响应值随着实验因素的改变愈加迟钝[23-24]。由图6可知，随着上样浓度和上柱液pH值增加，黄酮得率逐步增加，当两变量到达峰值，黄酮得率下降。等高线呈现椭圆形，两因素交互作用较强，影响显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.F006图6上样浓度和上柱液pH值对九节黄酮回收率的影响由图7可知，随着上样浓度增加，黄酮得率逐渐提高到最大，之后呈下降趋势；而随着上柱液pH值增加，黄酮回收率变化趋势较缓。等高线图显示，沿上样浓度轴等高线变化密集，表明上样浓度对响应值的影响比上柱液pH值影响显著。等高线呈圆形，表明两因素的交互作用不强，对结果影响不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.F007图7上样浓度和层析柱高径比对九节黄酮回收率的影响由图8可知，随着上样浓度增加，黄酮得率逐渐提高到最大，之后呈现下降趋势；随着乙醇浓度增加，黄酮回收率变化趋势较缓。等高线图显示，沿上样浓度轴等高线变化密集，表明上样浓度对响应值的影响比乙醇浓度影响显著。等高线呈圆形，表明两因素的交互作用不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.F008图8上样浓度和乙醇浓度对九节黄酮回收率的影响由图9可知，随着上柱液pH值和高径比增加，黄酮回收率呈增加趋势。等高线图显示，上柱液pH值轴等高线密集，层析柱高径比轴等高线相对稀疏，表明上柱液pH值对响应值峰值的影响比层析柱高径比交互作用强，影响显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.F009图9上柱液pH值和层析柱高径比对九节黄酮回收率的影响由图10可知，当上柱液pH值3~4时，黄酮回收率呈上升趋势；随着乙醇浓度增加，回收率略有下降。等高线图显示，沿上柱液pH轴等高线变化密集，表明上柱液pH值对响应值的影响比乙醇浓度影响显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.F010图10上柱液pH值和乙醇浓度对九节黄酮回收率的影响由图11可知，随着层析柱高径比增加，黄酮回收率先缓慢增加后下降，伴随乙醇浓度增加回收率同样不断增加。等高线图显示，沿层析柱高径比轴等高线变化密集，表明层析柱高径比对响应值的影响比乙醇浓度影响显著。等高线呈椭圆形，表明两因素的交互作用显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.015.F011图11层析柱高径比和乙醇浓度对九节黄酮回收率的影响研究表明，上样浓度和上柱液pH值、层析柱上柱液pH值和高径比、上柱液pH值和乙醇浓度、层析柱高径比和乙醇浓度交互作用显著，与方差分析结果一致。2.5最优条件的验证结果通过Design Expert 10.0.1软件中心组合法优化分析可得优化的最佳模型条件为上样浓度5.29 g/L、上柱液pH值3.89、层析柱高径比6.9∶1、以60.1%乙醇为洗脱液，理论值为87.59%；为了便于试验操作和设备自身精确度的影响，选取上样浓度5 g/L、上柱液pH值4、层析柱高径比7∶1、体积分数为60%乙醇洗脱液的条件下平行进行3次验证试验，测定其中总黄酮的回收率平均值为87.80%，相对偏差为0.207%，响应面法优化实际情况拟合结果较好，该模型可靠，模型建立成功。3结论本试验结果表明，HP-20型大孔吸附树脂能够较好地吸附和洗脱广西九节黄酮类化合物，其对总黄酮的比吸附量平均35.47 mg/g，吸附率平均70.88%，解吸率平均78.22%，为纯化广西九节总黄酮的最佳树脂类型。采用HP-20型大孔树脂吸附纯化广西九节中的黄酮，单因素试验结合响应面试验设计，建立九节黄酮回收率二次多项回归模型，优化出大孔树脂纯化九节黄酮的最佳工艺条件为上样浓度5 g/L、上柱液pH值4、层析柱高径比7∶1、以60%乙醇为洗脱液，验证值与理论值相接近，表明该模型可以较好地预测九节黄酮的树脂吸附法纯化回收率。