中华绒螯蟹（Eriochier sinensis）又称河蟹，属于甲壳纲十足目，是我国重要的养殖蟹品种，因其营养丰富且肉质鲜美而备受消费者的喜爱[1-2]。目前，中华绒螯蟹主要为池塘养殖，随着养殖规模迅速发展与扩大，病害问题也日益突出，水霉病、黑鳃病、烂肢病等疾病的频繁发生，严重影响了中华绒螯蟹的养殖效益[3-4]。使用抗生素和化学类药物可以防治中华绒螯蟹疾病发生[5]，但经常使用会导致水产动物的免疫力降低且体内重金属累积，危害人体和动物健康[6]，亟待找到无公害且能够提高水生生物抗病能力的添加剂。益生菌具有提高动物免疫功能、促进生长、调整肠道菌群平衡等特点[7]。丁酸梭菌是一种优质益生菌，为严格厌氧的革兰氏阳性厌氧杆菌[8]，可产生芽孢，在加工、制备饲料或贮藏、运输时出现高温、高压等情况仍具备很高的稳定性[9]。丁酸梭菌还具备耐胃酸、耐胆汁的特点，在消化道内不会失活[10]。Chaucheyras-Durand等[11]研究表明，丁酸梭菌能够分泌消化酶促进羔羊肠道消化，提高肠道的免疫能力，治疗肠道消化疾病。饵料中适量添加丁酸梭菌可以显著提高日本沼虾（Macrobrachium nipponense）肌肉中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性[12]。本研究在基础饵料中添加不同水平的丁酸梭菌，探究其对中华绒螯蟹肝胰腺抗氧化、非特异性免疫以及消化酶活性的影响，为其用作中华绒螯蟹饲料添加剂提供参考。1材料与方法1.1试验材料丁酸梭菌购自山东济宁市金山生物工程有限公司，为灰白色粉末状，丁酸梭菌活菌含量为≥1×108 CFU/g。基础饵料为商品幼蟹饵料，购自江苏省海普瑞饲料有限公司，基础饵料营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.012.T001表1基础饵料营养水平营养水平水分粗蛋白质粗脂肪粗灰分总磷含量≤12.0≥40.0≥5.0≤18.0≥1.0%1.2试验设计试验采用200只中华绒螯蟹幼蟹，由江苏省淡水水产研究所提供。试验在江苏省淡水水产研究所扬中基地进行，采用50 cm×40 cm×20 cm水箱进行暂养。暂养10 d后，从200只中华绒螯蟹中随机抽取120只体格健全、活力相似、平均体重（4.50±0.75）g的螃蟹，随机分为4组，每组5个重复，每个重复6只蟹。以丁酸梭菌产品使用说明书（推荐剂量为106 CFU/g）作为丁酸梭菌添加量的初步依据。对照组（G0组）幼蟹饲喂基础饵料，各试验组分别在基础饵料中添加105（G5组）、106（G6组）、107 CFU/g（G7组）丁酸梭菌。丁酸梭菌添加的具体方式为按照浓度梯度需求，计算所需基础饵料克数、丁酸梭菌原粉克数、纯净水体积，根据现有条件及实际生产指导说明，将配制好的丁酸梭菌原液用喷雾瓶均匀喷涂在饵料表面，整个过程保证原液的喷涂并保证饵料均匀沾上丁酸梭菌原液，自然晾干后进行称量投喂。试验期40 d。1.3饲养管理每日9：00和19：00投料，早晚分别投喂日投喂量的40%、60%，日投喂量为幼蟹体重的2%~4%，投喂量以幼蟹2 h能食用完毕为宜，视幼蟹具体摄食量进行调整。水温控制在22~25 ℃，且在水箱中放置一定数量的PVC管作为遮蔽物。每天早上及时清理残饵和粪便，记录蜕壳数，每3 d对水进行全面更换，用水为连续曝气3 d的自来水。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能养殖40 d后，中华绒螯蟹禁食24 h，每个水箱组随机抽取2只，将蟹体表的水分擦干进行称重，计算平均日增重、增重率、特定生长率。平均日增重=(Wt-W0)/d (1)增重率=(Wt-W0)/W0×100%(2)特定生长率=(lnWt-lnW0)/d×100%(3)式中：Wt为试验末期蟹体重（g）；W0为试验初期蟹体重（g）；d为试验周期。1.4.2肝胰腺抗氧化酶、免疫酶、消化酶活性以每个水箱中两只蟹的肝胰腺为一个样本，取肝胰腺，置于-80 ℃保存。检测指标包括总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、还原型谷胱甘肽（GSH）、胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶。送检公司为南京建成生物工程研究所。1.5数据统计与分析试验数据采用SPSS 28.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1丁酸梭菌对中华绒螯蟹幼蟹生长性能的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，在饵料中添加丁酸梭菌能够在一定程度上提高中华绒螯蟹的增重率和特定生长率，但差异均不显著（P＞0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.012.T002表2丁酸梭菌对中华绒螯蟹幼蟹生长性能的影响组别初重/g末重/g平均日增重/[g/(只·d)]增重率/%特定生长率/(%/d)G0组（对照组）4.49±0.776.24±0.930.046±0.01043.02±10.430.212±0.066G5组4.55±0.566.83±0.630.056±0.00751.03±10.630.233±0.069G6组4.14±0.396.23±0.450.052±0.00650.87±7.310.252±0.048G7组4.22±0.626.24±1.080.050±0.01447.53±9.830.233±0.0532.2丁酸梭菌对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺抗氧化指标的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，各试验组幼蟹肝胰腺T-AOC增强，SOD活性升高；G6组幼蟹肝胰腺T-AOC显著升高（P0.05），G7组幼蟹肝胰腺SOD活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.012.T003表3丁酸梭菌对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺抗氧化指标的影响组别T-AOC/(mmol/g prot)SOD/(U/mg prot)MDA/(μmol/g prot)CAT/(U/mg prot)GSH/(μmol/g prot)G0组（对照组）0.22±0.06b21.21±2.72b3.00±0.940.32±0.1111.04±2.30G5组0.30±0.04ab23.17±2.04ab3.33±0.790.28±0.0511.61±2.04G6组0.33±0.04a22.27±1.29b2.45±0.350.35±0.0510.93±2.34G7组0.32±0.06ab27.47±3.63a2.39±0.310.28±0.089.64±1.73注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.3丁酸梭菌对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺免疫指标的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，在饵料中添加丁酸梭菌能够在一定程度上改善幼蟹肝胰腺中免疫酶活性，但均未达到显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.012.T004表4丁酸梭菌对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺免疫指标的影响组别ACP/(金氏单位/g prot)ALP/(金氏单位/g prot)LZM/(U/mg prot)G0组（对照组）163.46±16.80186.46±18.5013.48±2.22G5组182.11±17.74193.65±11.5015.72±1.26G6组167.35±20.79159.65±17.3011.64±1.75G7组169.84±23.29177.75±19.0314.89±4.952.4丁酸梭菌对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺消化酶活性的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，各试验组幼蟹肝胰腺淀粉酶和脂肪酶活性均具有一定程度的提高；G6组肝胰腺脂肪酶活性显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.012.T005表5丁酸梭菌对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺消化酶活性的影响组别胰蛋白酶/(U/mg prot)淀粉酶/(U/mg prot)脂肪酶/(U/g prot)G0组（对照组）26 342.18±3 400.2156.26±8.931.17±0.22aG5组29 350.46±3 630.0673.52±14.141.02±0.23aG6组29 606.80±4 070.8761.82±8.481.86±0.05bG7组24 367.49±5 484.0761.39±11.031.45±0.43ab3讨论3.1不同水平丁酸梭菌对中华绒螯蟹生长的影响动物的生长性能可以反映改变某一因素时产生的变化，可作为衡量动物机体的综合指标[13]。近年来，益生菌功效的研究受到越来越多的关注，丁酸梭菌在肠道内的主要代谢产物丁酸可为动物的代谢供能。Li等[14]研究发现，在饵料中加入不同水平的丁酸梭菌投喂罗非鱼可显著提高增重率、特定生长率和生长速率，且适宜的添加量为105 CFU/g。樊英等[15]研究发现，在虹鳟饵料中添加丁酸梭菌能够显著提高虹鳟的特定生长率。类似的结果在鳗鲡[16]、凡纳滨对虾[14]及斑节对虾[17]等研究中均得到验证。本试验结果表明，与对照组相比，饵料中添加丁酸梭菌能够提高中华绒螯蟹幼蟹的增重率、特定增长率，但差异均不显著；且各增长指标与正常池塘养殖相比均有所降低。可能是由于养殖条件为室内水箱，饲养条件的物种多样性、光照条件均与池塘养殖存在差距，且在较小的空间下进行群养，中华绒螯蟹可能会进行打斗而造成饵料损耗，因而在生长性能的指标上未产生显著的影响。3.2不同水平丁酸梭菌对中华绒螯蟹抗氧化及免疫指标的影响中华绒螯蟹的免疫系统无特异性免疫，因而非特异性免疫在其免疫系统中起重要作用[4,18]；而在甲壳动物体内，抗氧化保护体系主要通过抗过氧化酶和还原性物质消除受自由基作用生成的过氧化代谢产物，防止其对动物体造成氧化损伤[19]。T-AOC是衡量机体抗氧化性能的综合指标[20]。SOD可以清除体内过多的自由基，CAT可以分解细胞内过多的过氧化氢，避免其氧化对机体造成损伤[21-22]。MDA由细胞质氧化而产生，对细胞具有毒害作用，可在一定程度上反映机体细胞受损伤的程度[23]。GSH作为还原性物质，能够在一定程度上反映机体的抗氧化性[24]。而ACP、AKP、LZM是甲壳动物免疫防御系统中重要的标志性酶，ACP和AKP在催化磷酸酯的水解和磷酸基团的转移中发挥重要作用[19,25]。本研究表明，添加丁酸梭菌能够显著提高中华绒螯蟹的T-AOC，与Duan等[20]发现饵料中添加丁酸梭菌能够显著增加凡尔滨对虾T-AOC的结果相符。本试验发现，添加丁酸梭菌也可显著提高幼蟹的SOD活性，与Li等[14]在饵料中添加丁酸梭菌能够显著提高虾SOD活性的结果相符。本研究选择对肝胰腺的免疫酶活性进行了测定，结果表明，相关指标测定有一定改善，但差异不显著，推测此结果可能与检测组织种类有关。3.3不同水平丁酸梭菌对中华绒螯蟹消化酶的影响肝胰腺产生的消化酶活性是衡量甲壳动物消化能力的指标，可以反映机体在不同条件下的生理反应[25]。发育迟缓和发育优越的虾在消化酶活性上存在明显差异，发育优越的虾脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶明显高于发育迟缓虾[26]。饲料中添加益生菌可以有效提高动物机体内消化酶的活性。刘明等[27]发现，不同水平酵母培养物可以显著提高南美白对虾肝胰腺中蛋白酶活性。胡亚军等[28]研究发现，复合益生菌可显著提升黄鳝的脂肪酶和淀粉酶活力。本试验测定中华绒螯蟹肝胰腺中胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性，发现各试验组幼蟹肝胰腺淀粉酶和脂肪酶活性均具有一定程度的提高。而甲壳动物体内的碳水化合物含量很少，主要以脂肪作为能源物质[29]。添加丁酸梭菌后，脂肪酶活性提升更利于中华绒螯蟹幼蟹对脂肪能源的利用，为丁酸梭菌作为饵料添加剂的可利用性提供了重要依据。4结论本试验发现，添加适量丁酸梭菌可以改善中华绒螯蟹抗氧化酶及消化酶活性，添加106 CFU/g丁酸梭菌能够对中华绒螯蟹的生长代谢起有效作用。