黄粉虫养殖中会产生大量的虫粪，与普通的禽畜粪便相比，虫粪具有干燥、颗粒细小均匀、无异味、便于搜集与运输等特点。由于黄粉虫的肠道简单，虫粪中仍富含营养物质[1]，若将虫粪合理利用可减少浪费，提高养殖的经济效益。黄粉虫虫粪可用于制备有机肥[2-3]、生物活性炭[4]、食用菌栽培的氮源[5]、养殖垫料[6]、饲料[7-8]等方面。研究表明，在蛋鸡日粮中添加10%黄粉虫粪可以提高蛋鸡产蛋率，降低料蛋比，提高鸡蛋的哈夫单位[9]。将黄粉虫粪、玉米粉、麸皮等混合，经适当处理后饲喂家畜，可提高家畜的饲料转化率和平均日增重[10]。在鹅日粮中添加20%~30%的黄粉虫粪可提高鹅的营养物质的表观消化率[11]。但关于黄粉虫粪在水产养殖中应用的研究较少。鱼的消化道短，为提高鱼饵料的转化率，通常将饵料原料进一步发酵处理。发酵饵料具有提升鱼的免疫力、改善水质、提升饲料品质等[12-14]作用。虾在生长发育过程中需经历多次蜕壳，因此，虾饵料中除了有蛋白质、脂肪、碳水化合物等营养物质的需求外，还需配合钙、磷等无机盐。本试验将黄粉虫粪、贝壳粉与其他辅料复配后，通过厌氧发酵后制得发酵饵料，以未发酵虫粪饵料及商品虾饵料对比，研究黄粉虫虫粪饵料发酵前后氨基酸、小肽、粗脂肪、有机酸等成分的变化情况，考察发酵饵料对虾生长性能的影响，为黄粉虫粪资源化利用及功能性虾饵料的制备提供参考。1材料与仪器1.1主要材料虫粪为收集黄粉虫食用餐厨垃圾、麦麸、蔬菜等产生的粪沙，由重庆博乐农业科技公司提供。混合乳酸杆菌1.0×108 CFU/g，购自固安桑普生化科技有限公司。黄粉虫幼虫粉自制，过40目筛。黄粉虫虫粪主要物质含量见表1。豆粕、全麦粉（饲料级）为市售。贝壳粉（饲料级，100目）购自广东聚鑫贝壳粉厂。红糖（食品级）为市售。小龙虾苗（Procambarus clarkii，单体重约0.7 g）由成都优耕生态农业公司提供。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.013.T001表1黄粉虫虫粪主要物质含量项目含量/%项目含量/(mg/g)项目含量/(mg/g)粗蛋白22.1K13.41Cd0.001粗纤维21.8Na9.12Cr0.002粗脂肪1.1Ca2.44Cu0.100粗灰分9.2Mg5.65Mn0.038淀粉9.0Zn0.07Pb0.003黑壳虾苗（Neocaridina denticulate）由成都优耕生态农业公司提供。高钙饲料（28蛋白型）购自河南南华千牧生物科技有限公司。1.2主要仪器与设备K1100F全自动Kjeldahl定氮仪（济南海能仪器股份有限公司）、JY2002型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）、Agilent1100高效液相色谱仪（配VWD检测器，安捷伦公司）、SZF-06A索式提取仪（上海书培实验设备有限公司）、iCAP-7200 ICP-OES等离子体光谱仪（赛默飞世尔科技公司）。1.3饵料的制备发酵虫粪饵料：采用本课题组发明的两段式发酵方法制备发酵饵料[15]，将贝壳粉、红糖、菌剂、水按照0.5∶0.5∶0.6∶10.0比例混合均匀后密封，在35 ℃下培养48 h，得发酵菌液，将全部发酵菌液与100份饵料原料（虫粪∶豆粕∶虫粉∶麦粉∶黏合剂比例为5.0∶2.0∶1.0∶2.0∶0.3）混匀，在35 ℃下再发酵48 h。将发酵好的物料烘干，采用辊式碎粒机制备成饲料颗粒，低温干燥至含水量小于13%，得发酵虫粪饵料。未发酵虫粪饵料：将饲料原料（虫粪∶豆粕∶虫粉∶麦粉∶黏合剂比例为5.0∶2.0∶1.0∶2.0∶0.3）混合均匀后，制成饲料颗粒，烘干。1.4测定指标及方法1.4.1粗蛋白取0.2 g样品（干重）于消解管中，加入10 mL浓硫酸和3.1 g催化剂（Cu2SO4与K2SO4的1∶30的混合物），置于石墨消解仪上在420 ℃消解至样品澄清透明，消解后冷却至室温，使用Kjeldahl定氮仪测定[16]。1.4.2小分子肽称取样品粉末5.000 g放入250 mL锥形瓶内，加入100 mL 150 g/L三氯乙酸溶液，摇晃均匀，恒温25 ℃振荡60 min，4 800 r/min离心15 min。倒掉部分上层液，取10 mL上清液于消化管中，加入10 mL浓硫酸和3.1 g催化剂（Cu2SO4与K2SO4的1∶30的混合物），置于石墨消解上，在420 ℃下消解至样品澄清透明，冷却至室温后，使用Kjeldahl定氮仪测定[16]。1.4.3粗脂肪称取样品5.0 g包入滤纸中，于105 ℃下烘2 h，将样品放入套管内，把套管放入索氏提取器中，使用石油醚提取，回流50次，取出样品，使用提取器回收石油醚直至抽提瓶全部收完，取抽取瓶，在水浴锅蒸馏除去溶剂，残渣在103 ℃下中烘2 h，在干燥器中冷却称重，再烘30 min，冷却称重，两次质量差小于0.001 g为恒重，抽提瓶前后重量差为粗脂肪含量。1.4.4有机酸有机酸的测定参考GB 5009.157—2016方法[17]。样品前处理：称取5.000 g样品于50 mL离心管中，加入20 mL超纯水，充分振荡，超声30 min，4 000 r/min离心5 min，取上层提取液至50 mL离心管，残留物使用20 mL超纯水重复提取1次，合并提取液于同一离心管，使用超纯水定容至50 mL，经0.22 µm水相滤膜过滤。液相检测条件：色谱条件为安捷伦ZORBAX SB-Aq色谱柱，250 mm×4.6 mm，粒度5 μm；流动相A为0.1%磷酸水溶液；流动相B为2%磷酸-甲醇；检测波长为210 nm；柱温40 ℃；流速1 mL/min；进样量10 µL。梯度洗脱过程参数见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.013.T002表2梯度洗脱过程参数时间/min流动相A流动相B097.52.5797.52.51520.080.01697.52.52597.52.5%1.4.5可溶性钙及总钙将1 g饵料放入50 mL离心管内，加入40 mL去离子水，70 ℃水浴，250 r/min振荡60 min，离心取上清液，采用ICP测试，计算可溶性钙含量[18]。取1 g烘干的样品放入坩埚中并放置在加热板上，使饲料炭化至无烟。将坩埚放入马弗炉中，于550 ℃下焙烧3 h，烧制后的粉末使用10 mL硝酸溶解，定容至100 mL，过滤，使用ICP测试计算饵料中总钙含量[19]。1.4.6氨基酸含量（1）样品前处理。游离氨基酸样品前处理：样品研碎，称取0.5 g样品于10 mL离心管中，加0.01 mol/L盐酸（或纯水）5 mL，混匀，沸水浴30 min，10 000 r/min离心10 min；取上清液，沉淀再加2 mL 0.01 mo/L盐酸悬浮超声5 min，离心，合并上清液，定容至10 mL，过膜测定。酸解氨基酸样品前处理：称取100.0 mg均匀样品于密封瓶中，加入10 mL 6 mol/L盐酸（含1%苯酚），充氮气1 min，封瓶，110 ℃水解22 h，取出冷却，加水稀释定容至50 mL，取1 mL样品95 ℃下氮吹挥干，准确加入1 mL 0.01 mol/L HCl溶解，过膜测定。（2）液相检测条件。在线柱前衍生：采用Agilent公司自动在线衍生化方法，一级氨基酸与邻苯二甲醛、二级氨基酸与芴甲氧羰酰氯衍生后过柱检测。色谱条件：ZORBAX Eclipse AAA（4.6 mm×75 mm，粒度3.5 μm）。检测信号：紫外338 nm（0~19 min），266 nm（19.01~25 min）。流动相A：40 mmol/L磷酸二氢钠（pH值7.8）；流动相B：乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10。流速：1.0 mL/min。梯度洗脱过程参数见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.013.T003表3梯度洗脱过程参数时间/min流动相A流动相B0100011000234657270100340100401000411000%1.5小龙虾饲养试验1.5.1试验设计及饲养管理试验在2周的水质适应期后，开始试验。随机选取300只小龙虾苗，平均分配至3个100 L水池（水深10 cm）中，每只小龙虾分别放入100 mL带孔隔离瓶中，过滤水的流速为2.0 L/min。将虾保持在环境温度，提供模拟的自然光周期（光∶暗=14∶10）。每个池固定投喂某一种饵料（高钙饵料、发酵虫粪饵料和未发酵虫粪饵料），分别于每天8：00和18：00投喂2次，饵料用量约为虾体重的5%。试验期2个月，以保证虾完成4次蜕壳。记录虾前10 d的体重变化、每次蜕壳的时间。1.5.2测定指标及方法1.5.2.1生长性能试验结束后，停食24 h，称虾的体重，计算体重增加率、饵料效率、蛋白质效率以及存活率。体重增加率(WG)=(末重-初重)/初重×100%(1)饵料效率(FE)=体重增加/采食量×100%(2)蛋白质效率(PER)=体重增加量/食入总蛋白质(3)存活率(SR)=最终虾数/初始虾数×100%(4)1.5.2.2蜕壳周期记录每只小龙虾的脱壳日期，计算脱壳的时间间隔。1.5.2.3虾壳含钙量将收集的小龙虾壳用水洗净，烘干，研磨成粉，准确称取0.500 g粉末放入坩埚中，550 ℃下焙烧3 h，使用硝酸溶解灰分，定容至100 mL，定容好的溶液使用滤膜过滤后稀释一定的倍数，使用ICP测定钙含量。1.5.2.4诱食性向养有若干黑壳虾的玻璃缸中放置两个投食皿，再向两个皿中分别投喂0.1 g的发酵饵料和高钙饵料，统计不同时间器皿上虾的数量、黑壳虾吃完饵料所需时间。1.6数据统计与分析数据采用SPSS 11.0进行单因素方差分析，Duncan's法多重比较。结果用“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1黄粉虫虫粪饵料中营养物质含量测定结果（见表4）由表4可知，发酵虫粪饵料的粗蛋白含量比未发酵虫粪饲料提高了9.6%。发酵虫粪饵料的小分子肽含量是未发酵虫粪饵料的3.8倍，是高钙饵料的2.9倍。发酵能够产生大量的乳酸，发酵发酵虫粪饵料中丙酸和异丁酸含量也有所提升。未发酵虫粪饵料、发酵虫粪饵料、高钙饵料的粗脂肪含量相差不大，但发酵虫粪饵料的水溶性钙含量明显提高，原因是发酵过程中产生的有机酸与贝壳粉反应，产生大量的水溶性钙，这些可溶性钙更利于虾对钙的吸收利用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.013.T004表4黄粉虫虫粪饵料中营养物质含量测定结果项目粗蛋白/%小分子肽/%粗脂肪/%乳酸/(mg/kg)丙酸/(mg/kg)异丁酸/(mg/kg)总钙/(mg/g)水溶性钙/(mg/g)发酵虫粪饵料32.11±0.394.11±0.224.43±0.15134.13±1.290.92±0.146.54±0.4229.09±0.4516.08±0.21未发酵虫粪饵料29.30±0.421.07±0.144.98±0.2438.00±1.010.43±0.095.79±0.2131.12±0.332.34±0.18高钙饵料28.62±0.481.41±0.135.21±0.29———27.32±0.413.54±0.24注：“—”表示未检出；下表同。2.2黄粉虫虫粪饵料中氨基酸含量测定结果（见表5）由表5可知，发酵虫粪饵料的游离氨基酸总含量是未发酵虫粪饵料的1.8倍，游离必需氨基酸总含量是未发酵虫粪饵料的3.1倍。3种饵料的酸解氨基酸含量相差较小，表明试验制备的发酵虫粪饵料和未发酵虫粪饵料的蛋白质和氨基酸含量均达到了商品饵料标准。发酵虫粪饵料的酸解氨基酸和酸解必需氨基酸的含量均有所提升，表明发酵有利于饵料营养成分的提升。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.013.T005表5黄粉虫虫粪饵料中氨基酸含量测定结果项目游离氨基酸酸解氨基酸发酵虫粪饵料未发酵虫粪饵料高钙饵料发酵虫粪饵料未发酵虫粪饵料高钙饵料非必需氨基酸天冬氨酸0.240.160.5811.4010.0311.11谷氨酸4.420.800.7128.1725.6535.71天冬酰胺0.600.120.48———丝氨酸0.680.170.438.347.617.67谷氨酰胺0.470.200.03———甘氨酸0.330.100.378.798.627.34瓜氨酸0.960.170.12———丙氨酸1.190.231.469.097.367.34酪氨酸0.660.170.465.674.694.52半胱氨酸0.010.050.090.960.770.83正缬氨酸0.180.141.42———羟脯氨酸11.719.8425.98———肌氨酸3.924.1011.88———脯氨酸0.960.381.218.129.5211.05必需氨基酸色氨酸0.180.040.74———苯丙氨酸1.440.521.037.835.926.90异亮氨酸0.610.120.345.934.694.56亮氨酸1.680.381.139.918.7410.10赖氨酸0.450.200.345.073.803.49缬氨酸0.830.200.806.415.525.52蛋氨酸0.300.070.322.101.691.93组氨酸0.310.230.062.992.542.70苏氨酸0.460.120.376.095.385.00精氨酸0.360.300.938.448.1210.12非必需氨基酸26.3216.6345.2280.5374.2585.56必需氨基酸6.622.176.0654.7746.3950.31总氨基酸32.9418.8051.28135.30120.64135.87mg/g2.3黄粉虫虫粪饵料对小龙虾生长性能及虾壳钙含量的影响（见表6）由表6可知，发酵虫粪饵料组小龙虾的体重增加率、存活率、蛋白质效率比均高于未发酵虫粪饵料组和高钙饵料组，表明发酵虫粪饵料的饲喂效果优于未发酵虫粪饵料和高钙饵料。通过乳酸菌发酵使饵料原材中的蛋白质被分解为更利于虾吸收的小肽和游离氨基酸，从而提升了饵料的营养价值和饵料中蛋白质的利用率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.013.T006表6黄粉虫虫粪饵料对小龙虾生长性能及虾壳钙含量的影响组别总末重/g总初重/g体重增加率/%饵料效率/%蛋白质效率存活率/%蜕壳周期/d虾壳钙含量/(mg/g)发酵虫粪饵料94.9±0.670.4±0.534.80±0.0152.3±0.51.6±0.199±111.0±0.5230.13±2.01未发酵虫粪饵料90.0±0.969.8±0.628.93±0.0244.1±0.31.5±0.198±212.0±1.0220.91±1.92高钙饵料87.5±0.771.1±0.423.07±0.0133.6±0.71.2±0.293±314.0±1.0178.04±1.41发酵虫粪饵料组小龙虾的脱壳周期最短，虾壳钙含量高，原因是经过发酵后饵料中的营养物质更容易被吸收，饵料效率更高，虾的生长更快。2.4发酵黄粉虫虫粪饵料和高钙饵料诱食性分析结果（见图1、图2）因在同一水池进行诱食试验，且有水流流动，为减少干扰，只选择本试验重点关注的发酵虫粪饵料和高钙饵料进行诱食性对比。由于小龙虾在同一水池易打斗，会影响试验结果，诱食试验替换为黑壳虾作为试验虾。由图1、图2可知，发酵虫粪饵料的器皿上黑壳虾的数量均多于高钙饵料的器皿。发酵虫粪饵料采食结束耗时约90 min，而高钙饵料采食结束耗时约180 min。研究表明，发酵虫粪饵料对黑壳虾具有更强的诱食效果，可能是因为发酵后饵料中所含大量的可溶性有机酸、游离氨基酸或其他小分子风味物质，使饵料具有特殊的气味，提升了饵料的诱食性和适口性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.013.F001图1诱食性试验结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.013.F002图2不同时间投食皿上虾的数量3讨论3.1黄粉虫虫粪饵料中粗蛋白和粗脂肪含量分析本试验中，发酵虫粪饵料的粗蛋白含量比未发酵虫粪饵料提升了约10%，原因是饵料发酵过程中，乳酸菌大量繁殖，将饲料原料中的非蛋白氮转化为菌体蛋白，从而提高饲料的蛋白质含量[20]。虾在不同生长时期对饵料中粗蛋白的含量要求不同，虾饵料中的粗蛋白含量需要达30%左右[21]。因此，本试验所用饵料均能够满足虾在脱壳期的蛋白质要求。本试验中，发酵饵料中的脂肪含量由发酵前的4.98%降为4.43%，原因是发酵过程微生物会产生一些脂肪酶[22]，使饵料中部分的脂肪被分解。虫粪饲料中脂肪含量主要来源是黄粉虫食物中未被黄粉虫所吸收的剩余脂肪以及黄粉虫粉中的脂肪。随着黄粉虫虫龄增加，其脂肪含量会逐渐升高。在实际生产过程中，可通过选择不同虫龄的黄粉虫虫粉控制饵料中的脂肪含量。脂肪主要为虾生长提供能量，其能量的含量是蛋白质和糖类的2.25倍。脂肪会被虾消化分解为甘油和脂肪酸，从而被虾利用。脂肪除了为虾提供能量之外，还可以促进虾对某些维生素的吸收，减少蛋白质作为能量消耗，有助于虾的生长。饵料的脂肪含量过低不利于虾的生长，饵料过高的脂肪含量容易导致饲料腐败，因此，一般虾饵料的脂肪含量控制在4%~8%[22-23]。3.2黄粉虫虫粪饵料中小分子肽和氨基酸含量分析本试验发现，发酵菌能够使黄粉虫粪以及其他成分中的大分子蛋白质分解成小分子肽，将饵料中的小分子肽含量由发酵前的1.07%提升至4.11%，从而提高虾对蛋白质的消化能力。部分小分子肽进一步分解，产生了游离氨基酸，使饵料中游离氨基酸的含量由发酵前的18.80 mg/g提升至32.94 mg/g；商品饵料中游离氨基酸的总含量达到51.28 mg/g，但主要是羟脯氨酸和肌氨酸的含量高导致，原因是饵料的原材料不同，所含氨基酸的种类也不同。但是羟脯氨酸和肌氨酸并非虾生长所必需的氨基酸，因此这2种氨基酸的含量并不能作为评判饵料好坏的标准。本试验中，发酵虫粪饵料中游离和酸解的必需氨基酸含量分别达到6.62、54.77 mg/g，与高钙饵料的含量几乎相同，表明发酵虫粪饵料中必需氨基酸总含量达到了商品饵料的标准，能够满足虾生长需求。3.3黄粉虫虫粪饵料中有机酸含量分析本试验结果发现，发酵虫粪饵料中乳酸的含量为134.13 mg/kg，是未发酵虫粪饵料的3.5倍。大量有机酸会降低饲料的pH值并有一定的杀菌作用，具有为饲料防腐的效果。溶解在水中的有机酸会与水中的氢氧根反应生成有机酸盐，从而达到降低和稳定pH值的目的。乳酸也常被用作酸化剂维持动物体内的酸碱平衡，提升动物的消化能力[24-25]。当食入带有活性乳酸菌的饲料后，乳酸菌会在肠道内形成优势菌种，并产生大量的乳酸，使肠道内的pH值减降低，抑制有害菌生长，甚至使有害菌的生长繁殖停止，从而达到提升动物肠道消化功能和自生免疫力的作用[26]。3.4发酵黄粉虫虫粪饵料对虾蜕壳时间的影响虾需要通过一次又一次地蜕壳和硬壳完成生长，因此需要从水和饵料中吸收大量的钙以满足生长需要。密集的养殖模式会让水中矿物质盐的含量严重不足，导致形成软壳病或者脱壳不遂，生长速度减慢，严重影响虾的正常生长[27]。本试验中，饵料中添加的贝壳粉经过发酵作用转化生成了有利于虾吸收的乳酸钙，发酵饵料中水溶性钙达到16.08 mg/g，是未发酵饵料的6.9倍，高钙饵料的4.5倍，因此饲喂发酵虫粪饵料的虾壳的钙含量最高，蜕壳周期也最短。本试验中，未发酵虫粪饵料的小龙虾平均蜕壳周期为12 d，比发酵虫粪饵料（11 d）稍长，但明显短于高钙饵料（14 d），虾壳含钙量也仅略低于发酵后的虫粪饵料，远高于高钙饵料。原因是未发酵虫粪饵料虽然水溶性钙仅为2.34 mg/g，但是其具有吸附水中Ca2+的功能，并且吸附的钙主要呈酸可溶态，利于被生物直接利用[28]。本试验中，饲喂高钙饵料小龙虾的死亡率达7%，并且死亡的时间与其蜕壳时间相重合，可能是因为虾缺钙，导致的脱壳不遂而死亡；在饲喂发酵虫粪饵料和未发酵虫粪饵料的小龙虾中死亡情况大大减少。4结论将黄粉虫粪、豆粕、黄粉虫幼虫粉、贝壳粉等按一定比例复配，通过乳酸二步发酵，获得了具有可溶性钙量高、小分子肽、有机酸和可溶性氨基酸含量高的发酵虫粪饵料。发酵后饵料有机酸含量提升了3.2倍，小分子肽含量提升了3.8倍，游离氨基酸含量提升了1.8倍。食用发酵虫粪饵料的小龙虾生长速度最快、脱壳周期最短、虾壳钙含量最高，发酵虫粪饵料对黑壳虾具有更强的诱食效果。