米尔伊丽莎白菌是一种广泛分布于自然环境中，能够感染人和动物的病原菌[1]，属于黄杆菌科伊丽莎白菌属，革兰氏阴性细菌。EMI能够感染蛙类和人类致病，但国内外相关报道较少。2008年美国报道了首例由EMI引起的人类感染病例[2]，其可引起机体免疫力较弱的成年人尿路感染[3]，感染后出现脓毒症、菌血症和脑膜炎[4-6]。2016年我国报道了1例EMI感染黑斑蛙的病例[7]。黑斑蛙是我国中南部地区的主要水产养殖产业，具有良好的生态效益和经济效益[8]，但黑斑蛙感染伊丽莎白菌的风险极大。蛙类感染EMI会出现大面积的暴发性死亡，对养殖户造成经济损失。因此，对EMI的有效防治尤为重要。伊丽莎白菌属中不同病原菌种间具有差异性，为病原菌的确定及防治增加了难度，并且EMI菌株已呈现多重耐药性，仅对少数检测抗生素（米诺环素、氟苯尼考、利福平和万古霉素）敏感[9]。因此，寻找合适的防治方法显得尤为重要。本试验拟从蚯蚓粪便中筛选出对EMI具有拮抗作用的菌株，对其最佳抑菌条件、抑菌活性物质进行进一步研究，为EMI的高效防治、研发新颖结构活性化合物提供参考。1材料与方法1.1试验材料EMI菌种（1.0×105 CFU/mL）由长江大学生命科学学院熊涛教授团队提供。PDA培养基[10]：马铃薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、琼脂 15.0 g/L、水1 000 mL，pH值自然，不加琼脂为PDB培养基。LB培养基：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氯化钠10.0 g/L、琼脂15.0 g/L、水1 000 mL，pH值7.4~7.6，不加琼脂为LB液体培养基。高氏一号培养基：可溶性淀粉20.0 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KNO3 1.0 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、琼脂15.0 g/L、水1 000 mL，pH值7.2~7.4，不加琼脂为高氏一号液体培养基。YG培养基：葡萄糖10.0 g/L、酵母提取物10.0 g/L、琼脂15.0 g/L、水1 000 mL，pH值7.0，不加琼脂为YG液体培养基。KMB培养基：蛋白胨20.0 g/L、甘油10.0 g/L、K2HPO4 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、琼脂15.0 g/L、水1 000 mL，pH值7.2，不加琼脂为KMB液体培养基。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、琼脂15.0 g/L、水1 000 mL，pH值7.4~7.6，不加琼脂为牛肉膏蛋白胨液体培养基。1.2测定指标及方法1.2.1EMI拮抗菌的分离采集湖北省荆州市拍马村蚯蚓养殖基地的蚯蚓粪便25 g，放入225 mL无菌水中，30 ℃、180 r/min振荡培养30 min，静置10 min，吸取1 mL上清液放入9 mL无菌水中，制备成10-2的稀释液，逐级稀释样品至10-4。分别吸取0.1 mL不同水平稀释液涂布于高氏一号平板上，28 ℃培养7 d，挑取单菌落并对其进行纯化。将纯化后的菌株接种至涂有EMI的LB培养基上，培养3 d，挑取圈径比最大的菌落（菌株编号LM-7），纯化后保藏。1.2.2拮抗菌LM-7的形态学鉴定将分离菌株（LM-7）划线接种于高氏一号培养基上，30 ℃培养7 d，观察菌落形态，对其进行革兰氏染色，使用光学显微镜观察菌体形态特征。1.2.3拮抗菌LM-7的生理生化特征分析参照《放线菌快速鉴定与系统分类》[11]，测定菌株LM-7对多种碳源的利用能力，进行淀粉水解、明胶液化等生理生化试验。1.2.4拮抗菌LM-7的分子生物学鉴定参照细菌基因组DNA的提取方法，对菌株LM-7的基因组DNA进行提取，以基因组DNA为模板，利用正反引物（27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTC-3'；1 492R：5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）对16S rRNA基因进行PCR扩增。PCR扩增体系为：TaqDNA聚合酶15 μL、正向引物反向引物各1 μL，DNA 2 μL、ddH2O 11 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，35个循环，72 ℃修复延伸7 min，14 ℃保存。PCR扩增产物送北京睿博生物技术有限公司进行测序。根据测序结果在NCBI中的GenBank数据库中进行BLAST分析比对，利用MEGA 7.0软件，采用邻接法，对与菌株LM-7具有高度相似性的15个菌株，构建系统发育树。1.2.5LM-7拮抗EMI的最佳培养基条件分别吸取0.1 mL的EMI菌液，涂布于PDA、KMB、LB培养基表面，使用直径为0.4 cm的打孔器在其培养基内部打孔，以相同方法从涂布有LM-7菌液的平板上取LM-7的菌块，将LM-7的菌块放入不同培养基的孔中，每个平板做3个重复，将平板放入37 ℃恒温培养箱中培养3~5 d，观察透明圈的大小。1.2.6不同发酵液对菌株LM-7生长的影响挑取LM-7的单菌落一环分别接入50 mL YG、PDB、KMB、高氏一号、牛肉膏蛋白胨和LB液体培养基中，每种培养基接种5瓶，于37 ℃、220 r/min条件下振荡培养，分别于培养第0、2、4、6、8 d各收集每种发酵液1瓶，12 000 r/min离心20 min，去掉上清，对离心管内沉淀的菌体分别称其湿重和干重，每测量值以扣除0 d测定的背景值为准。1.2.7菌株LM-7聚酮合酶基因（PKS）和非核糖体多肽合成酶基因（NRPS）的PCR检测PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 12.5 μL、A3F/K1/A (10 μmol/L) 0.5 μL、A7R/M6R/B (10 μmol/L) 0.5 μL、DNA模板1.0 μL、ddH2O 5.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃修复延伸5 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。相关基因的扩增引物序列[12-13]见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.016.T001表１PKS-Ⅰ、PKS-Ⅱ和NRPS基因的扩增引物序列基因名称引物序列退火温度/℃片段长度/bpNRPSA3F（5'-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3'）55674A7R（5'-SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3'）PKS-ⅠK1（5'-TSAAGTCSAACATCGGBCA-3'）551 040M6R（5'-CGCAGGTTSCSGTACCAGTA-3'）PKS-ⅡA（5'-TSGCSTGCTTGGAYGCSATC-3'）63383B（5'-TGGAANCCGCCGAABCCGCT-3'）1.2.8菌株LM-7抑菌活性物质测定挑取菌株LM-7的单菌落2个，分别接种至50 mL的PDB培养基中，在37 ℃、220 r/min条件下培养5 d。一瓶发酵液采取121 ℃、20 min高温高压蒸汽灭菌；另一瓶发酵液采用0.22 μm的微孔滤膜过滤。将无菌液以1∶50的比例与PDB培养基混合后倒平板，凝固后向平板中加入0.1 mL EMI菌液，使用涂布器涂布均匀，37 ℃培养3 d，观察EMI的生长情况。空白对照组以无菌水代替LM-7发酵液，其他操作相同。2结果与分析2.1菌株LM-7的分离、鉴定结果2.1.1菌株LM-7的菌落和菌丝体形态特征（见图1）从分离样品中共筛选出7株对EMI具有明显拮抗作用的菌株，其中LM-7的拮抗作用最为突出。由图1（a）可知，LM-7菌在高氏一号培养基上的单菌落为圆形；初期菌丝体白色，后期菌丝体为黄色。由图1（b）可知，LM-7菌体形态为丝状，有分支，无隔膜，以分生孢子进行繁殖，革兰氏染色为阳性。由图1（c）可知，菌落表面干燥、无光泽、不易挑起；菌体产灰黑色可溶性色素，初步判断为放线菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.016.F001图1菌株LM-7的菌落和菌丝体形态特征2.1.2菌株LM-7的生理生化特征及碳源利用结果（见表2）由表2可知，生理生化结果显示，菌株LM-7能够利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、肌醇、可溶性淀粉，但不能利用果糖。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.016.T002表2菌株LM-7的生理生化特征及碳源利用结果项目结果项目结果明胶液化+葡萄糖+硫化氢（H2S）+可溶性淀粉+黑色素产生+果糖-牛奶胨化+醇肌+硝酸盐还原+蔗糖+纤维素水解+麦芽糖+注：“+”为阳性；“-”为阴性。菌株LM-7明胶液化、硫化氢和硝酸盐还原试验结果呈阳性，产黑色素，能够水解纤维素，使牛奶发生胨化。2.1.3菌株LM-7的16S rRNA基因序列分析结果（见表3、图2）由表3可知，以菌株LM-7基因组DNA为扩增模板，利用引物27F/1492R对其16S rRNA基因序列进行扩增，将所得序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，发现菌株LM-7与Streptomyces sp. CPE377、Streptomyces antibioticus strain cfcc3075、Streptomyces antibioticus strain 66等9株菌相似性均在99%以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.016.T003表3与菌株LM-7序列相似度为99%以上的部分菌株结果项目总分覆盖度/%一致度/%登录号Streptomyces sp. CPE3772 56410099.93JN969031.1Streptomyces antibioticus strain cfcc30752 56410099.93FJ792547.1Streptomyces antibioticus strain 662 56010099.86MK430540.1Streptomyces antibioticus strain AAA192 56010099.86MG573217.1Streptomyces antibioticus strain SBRK32 56010099.86KX646402.1Streptomyces sp. strain IMB0942 56010099.86KY111376.1Streptomyces sp. strain ZFSM1-1462 56010099.86MW362453.1Streptomyces sp. strain MJM42892 56010099.86MT704493.1Streptomyces griseoruber strain cfcc30802 56010099.86MT704491.1利用MEGA7.0软件中的邻接法构建系统发育树，由图2可知，菌株LM-7与Streptomyces antibioticus strain聚类在一起，处于同一分支，两者相似度高达99.86%。结合之前形态和生理生化特征分析，将菌株LM-7鉴定为抗生链霉菌（Streptomyces antibioticus）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.016.F002图2菌株LM-7及相关菌株的系统发育树2.2菌株LM-7在不同培养基上对EMI的拮抗效果（见图3、表4）针对拮抗菌LM-7和病原菌EMI，试验选择了3种不同的培养基，观察拮抗菌LM-7和病原菌EMI在不同培养基上的拮抗效果。由图3、表4可知，PDA培养基上的圈径比最大，比值为11.13；LB培养基上的圈径比为3.30；KMB培养基上的圈径比最小，比值为2.50。结果表明，菌株LM-7和EMI的抑菌效果受培养基养分条件影响较大，而PDA培养基更利于LM-7和EMI产生拮抗作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.016.F003图3不同培养基上的抑菌圈形态10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.016.T004表4菌株LM-7和EMI的抑菌效果项目透明圈直径/cmLM-7菌落直径/cm圈径比PDA培养基4.450.411.13LB培养基1.300.43.30KMB培养基1.000.42.502.3不同培养基对菌株LM-7菌丝湿重、干重的影响（见表5）由表5可知，对菌株LM-7采用6种不同培养液进行培养后发现，KMB培养基内产生的菌丝体湿重和干重均为最大，PDB培养基的湿重和干重均最小。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.016.T005表5不同培养基对菌株LM-7菌丝湿重、干重的影响项目培养天数/d2468PDB湿重0.77±0.32c0.84±0.07d1.55±0.40b1.66±0.60d干重0.57±0.12b0.64±0.27c0.85±0.22c1.10±0.52d高氏1号湿重2.04±0.80b2.97±0.77c4.07±0.53a5.83±1.90bc干重1.27±0.69b1.66±0.67bc3.03±1.46ab3.18±0.49bcKMB湿重4.12±0.64a4.82±0.27a4.99±0.82a10.86±2.05a干重2.99±0.43a3.53±0.94a3.98±0.28a6.55±1.34aLB湿重2.37±0.83b4.51±0.82ab5.06±0.82a6.27±1.23bc干重1.35±0.58b1.96±0.83bc4.15±0.88a4.65±1.06bYG湿重2.12±0.43b2.34±0.81c2.64±0.78b3.59±0.82cd干重1.07±0.56b1.30±0.55c1.88±0.68bc2.04±0.54cd牛肉膏蛋白胨湿重1.80±0.47bc3.37±0.80bc4.40±0.49a8.10±1.78b干重1.07±0.32b2.67±0.84ab2.91±0.42ab4.52±1.55b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），含有相同字母表示差异不显著（P0.05）。g/50 mL2.4菌株LM-7聚酮合酶PKS及非核糖体多肽合成酶NRPS基因的PCR检测结果（见图4）由图4可知，菌株LM-7具有NRPS、PKS-Ⅰ和PKS-Ⅱ基因，表明菌株LM-7具备合成聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶的相关基因，具有产生聚酮类和非核糖体多肽类相关抗菌物质的条件。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.016.F004图4菌株LM-7的PKS-Ⅰ、PKS-Ⅱ及NRPS基因PCR扩增结果注：marker为DL 2000。2.5菌株LM-7抑菌活性物质测定结果（见图5）由图5可知，菌株LM-7的发酵液经高压蒸汽灭菌后会丧失抑菌活性，平板上布满EMI菌落（同CK处理）；而LM-7的发酵液经滤膜抽滤后，平板上未发现EMI菌落生长。研究表明，LM-7对EMI的抑菌活性成分主要存在于胞外，这类物质对高温比较敏感，121 ℃高温条件会使其丧失抑菌活性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.016.F005图5菌株LM-7抑菌活性物质测定结果3讨论链霉菌作为生防菌的一个重要类群，对很多病原菌均具有明显的拮抗效果[14]。链霉菌在促进植物生长方面具有一定的作用，如栗褐链霉菌（S. badius）具有固氮和解有机磷作用，并能够产生1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶和吲哚乙酸（AA）[15]。目前，分离出的链霉菌株主要用于防治植物病原菌，而在动物病原菌防治方面鲜有报道。本试验从蚯蚓粪便中分离筛选到1株对EMI具有较强拮抗作用的链霉菌，通过形态学、生理生化指标测定和16S rRNA测序，确定其为抗生链霉菌（Streptomyces antibioticus）。本研究中，系统发育进化树分析结果发现，LM-7与Streptomyces antibioticus（NR112299.1）种属关系最近。杨祁云等[16]报道，抗生链霉菌产生的活性化合物可抑制多种病原真菌，可为抗生素研发提供新资源。放线菌是临床医学上获得抗性活性物质的主要来源，其中链霉菌是获得抗性物质先导化合物的主要类群[17]。一般具有抗性的链霉菌均会具有非核糖体多肽合成酶（NRPS）和聚酮合成酶（PKS）这两类酶的合成基因，其是调控次级代谢物非核糖体多肽和聚酮类物质合成的关键酶，常作为筛选产生新颖结构天然活性化合物的微生物指示基因[18]。PKS和NRPS两类酶参与的代谢过程常常是分离研究药物抗性的关键步骤，可用于研制抗生素、抗癌、抗肿瘤药物和抗真菌剂等[19]。张斯颖等[20]通过对菌株NLG-3的检测发现，菌株NLG-3具有合成酶基因NRPS和PKS-Ⅱ，表明NLG-3可能分泌多肽类及芳香族的次生代谢产物。叶美金等[21]利用兼并性引物对渐绿木霉（Trichoderma viridescens）菌株SC-1的PKS和NRPS基因进行PCR扩增及序列测定分析，结果显示，菌株SC-1基因组中含有PKS Ⅰ、NRPS基因片段，表明渐绿木霉具有产生活性次生代谢产物的潜力。本试验发现，试验分离得到的链霉菌菌株LM-7的基因组中检测到NRPS、PKS-Ⅰ和PKS-Ⅱ基因。因此，推测LM-7可能会分泌多肽类及聚酮类芳香族的次生代谢产物，这些代谢产物与拮抗作用有关。本试验中，由菌株LM-7代谢产物活性与拮抗作用关系可知，使用滤膜抽滤方式对发酵液进行灭菌，滤液对EMI仍保持很强的抑菌效果；但采用高压蒸汽灭菌的方式处理发酵液，滤液对EMI的抑菌效果完全丧失，表明抑菌物质主要存在于胞外，而且这类物质对高温高压较为敏感。EMI通过感染蛙类，使其脑、肝、脾和肾脏组织出现病变、坏死和炎症细胞浸润，最终造成蛙类死亡[22]，对水产养殖已造成了严重损失。因此，在水产养殖过程中需要采用“以防为主，防治结合”的综合防治方法。目前对EMI的防治手段以抗生素为主。研究发现，四环素、替加环素、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合、利福平和氟喹诺酮类药物对伊丽莎白菌临床分离株具有较高的体外活性[23]，伊丽莎白菌对米诺环素、替加环素、利福平、左氧氟沙星的敏感率分别为100.0%、78.8%、76.9%和71.2%。EMI分离菌株均对氟喹诺酮类药物敏感，EMI对多种β-内酰胺类药物已表现出内在耐药性[24]。氟喹诺酮类（如左氧氟沙星）药物可有效抑制EMI菌株，而本试验分离的抗生链霉菌具有聚酮合成酶（PKS）类合成基因，可产生相关酮类代谢产物，有效抑制EMI的生长。周永灿[25]研究表明，甲醛灭活疫苗可明显提高其对EMI的抵抗能力。吴兴镇[26]认为五味子、柯子、半枝莲、五倍子，乌梅等植物性药物对EMI有较好的抑菌效果。本试验发现，LM-7对EMI具有较好的拮抗效果，可为EMI的防治提供新思路。4结论本试验从蚯蚓粪便中分离得到一株对EMI具有较强拮抗作用的抗生链霉菌菌株LM-7。菌株LM-7在PDA培养基上对EMI的抑菌效果最佳，其抑菌活性物质主要存在于细胞的胞外分泌物中。抑菌活性成分与非核糖体多肽和聚酮类次级代谢产物有关。LM-7菌株可作为防治EMI的备选菌株，其发酵液具有开发成为新颖结构活性化合物的潜力。