鱼粉经常作为饲料蛋白的主要来源，但鱼粉原料贮存不当时，原料中的组氨酸经具有脱羧酶活性的微生物的脱羧作用产生组胺，而组胺与鱼粉中的游离赖氨酸结合，产生一种具有高度活性的胺类化合物——肌胃糜烂素[1-2]。与鱼粉中常见毒素成分组胺相比，肌胃糜烂素毒性剧烈，约是组胺的1 000倍，若鱼粉中含有的肌胃糜烂素含量范围超过0.3 mg/kg，易导致鸡胃部发生病变，出现食欲减退、肌胃层糜烂、嗉囊肿大、溃疡甚至胃部穿孔等病症，严重情况下会造成鸡吐血死亡[3-9]。肌胃糜烂素引起的病症已得到养殖业的关注[10]。甜叶菊是一味中药也是天然甜味剂，对龋齿、高血压等疾病具有一定的防治作用[11]。甜叶菊已广泛应用于鱼、虾、猪的养殖中，具有提高动物抗病力的作用[12-15]。本试验利用日本东北大学清田洋正教授赠予的合成标准肌胃糜烂素样品，开展甜叶菊对肌胃糜烂素引起雏鸡肌胃层病症的解毒作用效果研究，为肌胃糜烂素致禽类病症的防治提供参考。1材料和方法1.1试验材料与试剂1.1.1试验材料4日龄雏鸡及雏鸡日粮购自广州化龙市场。1.1.2试剂与仪器甜叶菊由亳州市佰林堂药业有限公司提供，肌胃糜烂素由日本东北大学实验室合成，亚硝酸钠、乙酸钠、无水碳酸钠购自天津大茂化学试剂厂，无水对氨基苯磺酸购自广州化学试剂厂。Pauly重氮衍生试剂的制作：衍生试剂a1：1 000 mL的1 mol/L盐酸溶液中加入20 mmol对氨基苯磺酸，使用0.45 μm水滤膜过滤，置于冰箱保存。衍生试剂a2：使用1 000 mL去离子水溶解20 mmol亚硝酸钠，使用0.45 μm水滤膜过滤，滤液置于冰箱保存。衍生试剂a：发色液a1和发色液a2按照1∶1体积比混匀直接使用。发色液b：于5%乙醇溶液中溶解10%无水Na2CO3，使用0.45 μm水滤膜滤，常温保存。分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）、高效液相色谱仪（日本岛津集团 LC-20AT）、高速冷冻离心机（湖南湘仪仪器设备有限公司）、二元梯度泵（日本岛津集团）、光学显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）、电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）、SPD-M20A（日本岛津集团）、色谱柱（美国菲罗门公司 C18 110A柱）。1.2试验设计因日龄较小的雏鸡便于试验，在市场购买体重相近的8只4日龄雏鸡（试验中原本9只雏鸡，遗失1只），分为3组并做标记，每天记录雏鸡重量及形态变化。肌胃糜烂素组：3只雏鸡，使用红线和绿线在雏鸡脚上标记，每日每只鸡饲喂为10 mg/kg的肌胃糜烂素标样。甜叶菊+肌胃糜烂素组：2只雏鸡，使用棉线在雏鸡脚上标记，每日每只鸡饲喂为10 mg/kg的肌胃糜烂素和2 000 mg/kg的甜叶菊提取物。空白对照组：3只雏鸡，使用白线在小鸡脚上标记。按照雏鸡饲料喂养标准，每天喂养200 g日粮。试验中添加肌胃糜烂素剂量和甜叶菊的剂量参考文献[16]至文献[18]。试验期间雏鸡正常饮水和投喂。3组雏鸡在箱子内饲养1周。雏鸡日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.017.T001表1雏鸡日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.0玉米62.0代谢能/(MJ/kg)12.00豆粕31.0粗蛋白/%21.00麦麸3.2钙/%1.00磷酸氢钙1.3有效磷/%0.50石粉1.2赖氨酸/%0.86鱼粉0.3蛋氨酸+胱氨酸/%0.90预混料1.0注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 8 000 IU、VD3 5 000 IU、VE 45.0 mg、VK3 12.8 mg、VB1 3.2 mg、VB2 13 mg、VB6 18mg、VB12 0.01 mg、Mn 80 mg、Fe 80 mg、Cu 20 mg、Zn 70 mg、Se 0.22 mg、生物素 15 mg、烟酸30 mg、泛酸钙 15 mg、叶酸 2.2 mg、氯化胆碱800 mg。2.营养水平均为计算值。1.3测定指标及方法1.3.1体重每天观察雏鸡情况，试验开始称量雏鸡体重，试验每日相同时间称量雏鸡体重，记录体重数据。1.3.2生理指标试验最后1 d，雏鸡进行解剖，观察并记录雏鸡内脏变化情况，取出雏鸡胃测定相关指标。1.3.2.1胃液量及pH值雏鸡的胃部剖开，去除残留物，收集胃液，使用生理盐水冲洗胃黏膜，将胃液及含有黏膜的冲洗液于器皿内混合。混合液置于离心管，12 000 r/min离心15 min，分别取上清液，测量胃液体积，采用高级pH试纸直接测量胃酸pH值，记录数据。1.3.2.2胃蛋白酶活性采用麦特（Mett）氏毛细玻管法测定胃蛋白酶活性。制作充满蛋白的玻璃毛细管，取长10 cm、内径1 mm干净的玻璃毛细管，将蛋清填于玻管内制成蛋白管。蛋白管放入100 ℃沸水加热1 min，蛋白凝固后，取出蛋白管，各取雏鸡的混合胃液0.2 mL，加入0.05 mol/L HCl溶液10 mL到培养皿中，摇匀，调节至pH值为2，放入3根蛋白管，在37 ℃恒温箱中孵育24 h，取出蛋白管，测出3根蛋白管两头透明部分的长度，求平均值。胃蛋白酶活性单位=平均值2×16(1)1.3.2.3解剖学的肌胃形态观察分别取各组1例雏鸡肌胃，观察形态。1.3.2.4腺胃黏膜切片观察肌胃糜烂素组、甜叶菊+肌胃糜烂素组各取2例腺胃黏膜，空白对照组取1例腺胃黏膜，制作腺胃黏膜切片观察甜叶菊的作用效果，试验雏鸡分组及编号见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.017.T002表2试验雏鸡分组及编号病理号标记位置剂量组20140379红左肌胃糜烂素组20140380红右20140382棉左肌胃糜烂素+甜叶菊组20140383棉右20140384白右空白对照组腺胃样品5例采用10%中性福尔马林溶液固定，脱水、包埋，制作石蜡切片（厚约3 µm），切片58 ℃烘干过夜，脱蜡，经无水乙醇、梯度乙醇水化液，苏木素液、0.5%伊红溶液染色，梯度乙醇脱水，透明剂透明和树胶封片，通过显微镜观察。组织病理病变分级标准见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.017.T003表3组织病理病变分级标准项目未观察到组织学改变0~20%21%~40%41%~100%分级正常轻度中度重度注：百分比为取样标本组织切面的百分比。1.3.3肝脏肌胃糜烂素的测定1.3.3.1样品采集雏鸡解剖，取出肝脏（肝脏易碎），依据Masumura等[9]的方法处理肝脏，检测肝脏中的肌胃糜烂素的含量。取200 mg小鸡肝脏加入5倍的0.1 mol/L HCl溶液，搅碎混匀，12 000×g离心15 min，取1 mL上清液，使用0.2 μm过滤膜过滤，取过滤液20 μL于上样管中加入10 μL发色液A，加入30 μL发色液B，经振荡器混合均匀，取10 μL进行HPLC分析。1.3.3.2高效液相色谱法色谱条件流动相A：52.5 mL 5%乙醇溶解于1 L的150 mmol/L醋酸钠缓冲液，使用醋酸调pH值至6.0，用0.45 μm的水滤膜对流动相A过滤。流动相B：将乙腈和水进行3∶2体积比混合，使用0.45 μm有机滤膜对流动相B过滤。检测波长：420 nm；总流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。梯度程序：0~30 min内流动相A从100%降至45%；0~30 min内流动相B从0%提升至55%。通过试样中的肌胃糜烂素的峰面积比对标样溶液中的肌胃糜烂素的峰面积，计算试样中的肌胃糜烂素的含量，计算试样中肌胃糜烂素的质量分数（x）。x=A2A1×m1m2×p×D (2)式中：A1为两针标样溶液中肌胃糜烂素峰面积的平均值；A2为两针试样溶液中肌胃糜烂素峰面积的平均值；m1为标样中肌胃糜烂素的含量（mg）；m2为试样的含量（mg）；p为标样中肌胃糜烂素的质量分数；D为稀释倍数，为1/5。1.4数据统计与分析数据通过SPSS 24软件进行单因素方差分析，LSD法进行多重比较，结果以平均值表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1试验期间雏鸡的体重变化（见表4）由表4可知，肌胃糜烂素组雏鸡体重增长速度低于喂养甜叶菊＋肌胃糜烂素组和空白对照组。研究表明，肌胃糜烂素具有抑制小鸡生长的作用，而甜叶菊对肌胃糜烂素引起的小鸡病症具有一定的解毒作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.017.T004表4试验期间雏鸡的体重变化项目第1 d第2 d第3 d第4 d第5 d第6 d第7 d肌胃糜烂素组红左57.6851.5660.1757.4059.8970.6874.91红右58.4851.3554.7765.0465.8674.3280.96绿右58.3951.1346.4542.5939.7638.15—甜叶菊＋肌胃糜烂素组棉左57.7859.1668.2877.2378.7792.4698.84棉右61.8758.1667.3466.8668.2470.5167.51空白对照组白左72.5676.4682.5692.12103.33114.67120.29白右63.2970.5280.3393.76103.48117.98123.12毛右64.0273.1784.1096.27106.86120.34126.82注：“—”表示饲喂第7 d雏鸡死亡。g/只2.2雏鸡的肌胃变化情况（见图1）由图1可知，肌胃糜烂素组雏鸡的肌胃黏膜肿胀，内容物呈稀糊状，而且肌胃有糜烂红色小斑点，甜叶菊＋肌胃糜烂素组与正常空白对照组差异较小，雏鸡肌胃变化不明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.017.F001图1小鸡肌胃的变化情况2.3各组雏鸡胃液量和pH值变化（见表5）由表5可知，肌胃糜烂素组雏鸡的胃液量比空白对照组增加了96.6 μL，甜叶菊＋肌胃糜烂素组雏鸡的平均胃液量比空白对照组增加了53.3 μL，比肌胃糜烂素组降低了43.3 μL；甜叶菊＋肌胃糜烂素组雏鸡的胃液pH值比空白对照组降低了0.6，比肌胃糜烂素组增加了0.7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.017.T005表5各组雏鸡胃液量和pH值变化项目胃液量/μL胃液量平均值/μL胃液pH值胃液pH值平均值肌胃糜烂素组红左350303.32.32.3红右3002.5绿右2602.1甜叶菊＋肌胃糜烂素组棉左250260.03.13.0棉右2702.9空白对照组白左190206.73.63.6白右2103.7毛右2203.52.4各组雏鸡胃蛋白酶活性测定结果（见表6）由表6可知，肌胃糜烂素组雏鸡的胃蛋白酶活性高于空白对照组，甜叶菊＋肌胃糜烂素组雏鸡胃蛋白酶活性略高于空白对照正常组，低于肌胃糜烂素组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.017.T006表6各组雏鸡胃蛋白酶活性测定结果项目平均长度/mm胃蛋白酶活性/(U/mL)肌胃糜烂素组红左3.85237.16红右4.07265.04绿右3.45190.44甜叶菊＋肌胃糜烂素组棉左3.33177.42棉右3.51197.12空白对照组白左3.27171.09白右3.19162.82毛右3.26170.042.5各组雏鸡腺胃黏膜切片观察结果（见图2~图6）由图2、图3可知，肌胃糜烂素组雏鸡（红左）的腺胃层局部胃黏膜上皮坏死（40%~50%），固有层可见少量淋巴细胞浸润（1%~5%）；雏鸡（红右）腺胃局部胃黏膜上皮坏死（20%~30%），排列紊乱，固有层可见灶状淋巴细胞浸润（10%~20%）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.017.F002图2肌胃糜烂素组（红左）雏鸡腺胃黏膜HE染色结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.017.F003图3肌胃糜烂素组（红右）雏鸡腺胃黏膜HE染色结果由图4、图5可知，肌胃糜烂素＋甜叶菊组雏鸡（棉左）局部黏膜固有层可见灶状淋巴细胞浸润现象（5%~10%）。雏鸡（棉右）肌胃层部分胃黏膜上皮细胞坏死（10%~20%），固有层可见灶状淋巴细胞浸润（5%~10%）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.017.F004图4肌胃糜烂素＋甜叶菊雏鸡组（棉左）腺胃黏膜HE染色结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.017.F005图5肌胃糜烂素＋甜叶菊组雏鸡（棉右）腺胃黏膜HE染色结果由图6可知，空白对照组雏鸡局部胃黏膜固有层可见灶状淋巴细胞浸润（5%~10%）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.017.F006图6对照组雏鸡（白右）腺胃黏膜HE染色结果综上，胃糜烂素组雏鸡胃黏膜糜烂程度大于甜叶菊+肌胃糜烂素组，甜叶菊对肌胃糜烂素具有一定解毒作用。2.6雏鸡肝脏中肌胃糜烂素含量测定结果（见表7）由表7可知，甜叶菊＋肌胃糜烂素组雏鸡肌胃糜烂素平均值为2.035 mg/kg，略低于肌胃糜烂素组；空白组雏鸡未检出肌胃糜烂素。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.017.T007表7雏鸡肝脏中肌胃糜烂素含量测定结果项目肌胃糜烂素平均值肌胃糜烂素组红左2.242.660红右3.43绿右2.30甜叶菊＋肌胃糜烂素组棉左2.502.035棉右1.57空白对照正常组白左00白右0毛右0mg/kg3讨论3.1甜叶菊对雏鸡的生长性能的影响甜叶含有黄酮、绿原酸、糖苷等活性成分，具有抗菌、氧化、增强畜禽生长发育、提高生产性能等作用，能够提高雏鸡生长性能，增强免疫力[12-13]。本试验发现，肌胃糜烂素组雏鸡体重增长速度变小，并且有死亡情况；甜叶菊+肌胃糜烂素组雏鸡比空白对照组体重增长速度小，高于肌胃糜烂素组。钟敏等[13]发现，日粮中添加0.1%~0.5%甜叶菊渣对宁都黄鸡的平均日采食量无显著影响，但可提高平均日增重。李圆圆等[19]研究表明，添加益生素和甜叶菊提取物可促进青脚麻鸡生长。本试验结果与上述结论一致，原因可能是甜叶菊能够增强雏鸡的免疫性能，有效抑制肌胃糜烂素引起的相关病症，提高饲料利用率，降低养殖风险，促进生长发育。3.2甜叶菊对小鸡胃囊形态的影响鸡腺胃呈椭圆形，能够分泌胃酸，降低腺胃内食物pH值，使胃蛋白酶更好地分解蛋白质营养物质[20]。肌胃位于腺胃后方，具有研磨粉碎的功能。本研究显示，喂食肌胃糜烂素的雏鸡腺胃肿大，肠道黏膜肿胀，内容物呈稀糊状，腺胃分布红色小斑点，组织切片的腺胃层局部胃黏膜上皮细胞40%~50%坏死，固有层可见1%~5%淋巴细胞浸润；胃酸量增加96.6 μL，pH值降低1.3，肌胃层黏膜出现糜烂现象。喂食甜叶菊和肌胃糜烂素组雏鸡器官变化不明显，与空白组差异不大，但胃黏膜也出现了轻微糜烂现象；胃酸量变化幅度、肌胃糜烂素含量低于肌胃糜烂素组，且肌胃糜烂素导致胃蛋白酶活性升高，但添加2 000 mg/kg的甜叶菊能够降低胃蛋白酶活性。Takahashi等[16]发现，日粮中添加0.2%甜叶菊活性成分能够减弱组胺引起的雏鸡肌胃糜烂病症。研究发现，添加甜叶菊的活性成分能够减弱组胺引起的虹鳟鱼胃囊糜烂现象[18-19]，与本试验结果一致，表明甜叶菊对肌胃糜烂素致雏鸡肌胃病症具有一定的解毒作用。3.3甜叶菊对小鸡肝脏中肌胃糜烂素的影响由于市面没有肌胃糜烂素的标准品，导致肌胃糜烂素的相关研究甚少。本试验中，肌胃糜烂素组雏鸡的平均肌胃糜烂素为2.66 mg/kg，而甜叶菊＋肌胃糜烂素组雏鸡的肌胃糜烂素平均值为2.035 mg/kg，空白组未能检测到肌胃糜烂素，与Takahashi等[16]研究结果一致。4结论本研究结果表明，肌胃糜烂素对雏鸡生长具有一定的抑制作用，使雏鸡肌胃出现糜烂现象，而甜叶菊对肌胃糜烂素具有一定的解毒作用。