随着人类对环境保护的要求越来越高，畜牧业对饲料的要求也越来越高。新型饲料既要营养价值高，还要对环境污染小。在养殖过程中，因动物肠胃对无机铜元素的吸收效率比较低，导致大量无机铜随粪便排出体外，造成环境污染[1]。动物肠胃对有机铜的吸收效率明显高于无机铜，而酵母菌对铜具有一定的耐受能力，可将无机态的铜元素转化成便于动物吸收的有机铜。研究表明，酵母铜的生物利用率显著高于硫酸铜和乙酸铜[2]。天然的酵母菌可通过驯化的方式提高其耐铜特性和富铜能力[3]。在前期的研究中，本课题组通过驯化的方式获得一株能够耐受600 mg/L铜浓度的啤酒酵母菌，该酵母菌在200 mg/L铜浓度下得到的富铜酵母铜含量为12.97 mg/kg[4]。象草营养丰富，其粗蛋白含量为12.3%，粗纤维含量为24.59%，粗脂肪含量为3.1%[5]。象草成株纤维含量较高不能直接用于单胃动物的养殖。但猪大肠微生物区系中存在高活性的瘤胃纤维分解菌和半纤维分解菌，可直接食用幼嫩的象草和象草汁[6]。非常规饲料经益生菌发酵后，能够提高饲料中蛋白质、脂肪和糖类等营养成分的转化率，提高原有饲料的营养价值，扩大饲料的使用范围[7-9]。玉米秸秆、豆粕、象草、果皮、棉籽等经过微生物发酵后可用做畜禽养殖饲料，既能提高营养利用率，又可以降低饲料成本[10-15]。酵母菌是能够直接添加到饲料中用于生产的发酵常用菌，若用于发酵的酵母菌本身含有大量的有机铜，且对象草具有良好的发酵作用，将会极大地提高象草的营养价值和饲用范围，降低饲料源无机铜的环境污染。因此，本研究将获得的耐铜啤酒酵母菌进行优化，并将其对象草进行发酵，以探究经铜驯化和富集铜后的CTY和CRY对象草营养成分的影响及其作为猪饲料的可行性。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种及制备MSR：活力99增香青贮微贮剂，200 g/包，由宜春微生物强微生物科技有限公司提供。主要菌种包括产朊假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌。菌种浓度：产朊假丝酵母菌≥40×108 CFU/g，枯草芽孢杆菌≥40×108 CFU/g，乳酸片球菌≥20×108 CFU/g。CTY：能耐受含铜量为400 mg/L，培养基保有良好活性的酵母菌，菌体铜含量为5 mg/kg。此酵母菌通过将初始啤酒酵母菌经逐步提高培养基铜浓度的方式驯化而得，具体驯化方法详见此项目的前期研究结果[4]。为保持酵母菌良好的活性，此次驯化的最高铜浓度为400 mg/L。初始啤酒酵母菌由北京北纳创联生物技术研究院提供（保藏号：336058）。CRY：菌体铜含量为7.3 g/kg。此酵母菌通过将上述获得的CTY菌株在最佳铜富集浓度200 mg/L，温度为28~30 ℃，pH值6.2±0.2的条件下培养24 h而得。具体培养方法基配方详见此项目的前期研究结果[4]。1.1.2象草处理象草品种为桂闽引象草。将高2~2.5 m成熟的桂闽引象草收割，粉碎成直径小于0.3 mm，长度小于3~5 mm的象草粉，自然控干水分至30%~40%，作为酵母菌发酵基础料备用。1.2试验方法试验共设置C组、MSR组、LCTY组、MCTY组、HCTY组和CRY组。C组不添加发酵菌；MSR组添加65 mg/kg MSR菌；LCTY组、MCTY组、HCTY组添加25、50、100 mg/kg的CTY菌。CRY组添加10 mg/kg的CRY菌。将发酵菌与象草粉混合均匀后，装入发酵袋中，将发酵袋空气排空，置于28~30 ℃温度中静置发酵20 d。发酵完成后测定象草的pH值、干物质（DM）、粗灰分（Ash）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、粗纤维（CF）、无氮浸出物（NFE）、总氨基酸（AA）、钙（Ca）、总磷（TP）、总能（GE）和氨基酸全样分析。1.3数据统计与分析采用SPSS 16.0软件进行统计分析，结果以“平均值±标准差”表示。P0.05表示差异显著，P0.05表示差异不显著。2结果与分析2.1不同酵母菌发酵后象草pH值、颜色、味道及饲喂效果的影响（见表1）由表1可知，不同酵母菌发酵后象草pH值降低，pH值在4~4.5之间，呈明显的酸性。与C组相比，MSR组与HCTY组pH值略低于C组、LCTY组、MCTY组；CRY组的pH值与C组相近。不同酵母菌发酵20 d后，象草退去青色，变成浅黄色，CTY和CRY发酵后，象草颜色与C组及MSR组相近。发酵后C组象草料有酸味；MSR组象草发酵料有较浓的香甜气味；不同浓度的CTY组和CRY组象草发酵料有淡淡甜味。将不同浓度的CTY组和CRY组象草发酵料投喂40~50 kg的中猪，采食状况良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.017.T001表1不同酵母菌发酵后象草pH值、颜色、味道及饲喂效果的影响项目C组MSR组LCTY组MCTY组HCTY组CRY组pH值4.54.04.54.34.04.4颜色浅黄色浅黄色青黄色青黄色青黄色青黄色气味酸味较浓的香甜味淡淡的甜味淡淡的甜味淡淡的甜味淡淡的甜味试喂效果采食采食采食采食采食采食2.2不同酵母菌发酵后象草营养成分含量（见表2）由表2可知，添加微生物发酵后，象草发酵料中的干物质、粗灰分、无氮浸出物、总磷、总能含量发生显著变化（P0.05）。其中与C组相比，添加菌剂的象草发酵组干物质无显著差异（P0.05），只有LCTY组与MSR组相比，LCTY组中的干物质含量显著升高（P0.05）。与C组相比，MSR组、MCTY组、HCTY组中粗灰分的含量显著降低（P0.05）。HCTY组中无氮浸出物含量显著升高（P0.05）。分别与C组和LCTY组相比，MCTY组和CRY组中总磷含量显著降低（P0.05）。与MSR组相比，LCTY组总能含量显著降低（P0.05），而与LCTY组相比，MCTY组中的总能含量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.017.T002表2不同酵母菌发酵后象草营养成分含量项目C组MSR组LCTY组MCTY组HCTY组CRY组干物质/%34.68±3.45ab29.46±0.27b35.20±1.50a29.88±3.34ab30.50±3.34ab33.32±2.52ab粗灰分/%2.88±0.26a2.25±0.03b2.43±0.12ab2.41±0.13b2.38±0.10b2.72±0.81ab粗蛋白/%9.40±0.239.41±0.439.26±0.289.26±0.349.46±0.589.53±0.67粗脂肪/%2.56±0.272.26±0.242.12±0.362.49±0.242.39±0.172.29±0.31粗纤维/%41.00±0.4040.23±1.6639.13±3.3641.10±1.5941.10±0.2041.70±1.05无氮浸出物/%27.53±0.32b30.27±2.35ab30.93±3.06ab29.03±1.33ab29.10±0.26a28.53±1.33ab总氨基酸/%6.36±0.116.50±0.296.32±0.156.36±0.086.66±0.526.54±0.46钙/(g/kg)8.77±0.517.87±0.509.40±1.447.60±1.118.93±1.227.60±0.75总磷/%0.53±0.02a0.48±0.03ab0.53±0.02a0.45±0.03b0.53±0.08ab0.45±0.04b总能/(J/kg)10.99±0.17ab11.16±0.04a11.04±0.04b11.2±0.04a11.16±0.13ab11.16±0.13ab注：同行数据肩标无字母或字母相同表示差异不显著（P0.05），字母不同表示差异显著（P0.05）；下表同。2.3不同酵母菌发酵后象草氨基酸含量（见表3）由表3可知，不同酵母菌发酵后，象草发酵料中总氨基酸含量变化不大，脯氨酸、甘氨酸、组氨酸含量发生显著变化（P0.05）。与C组相比，CRY组的脯氨酸含量显著升高（P0.05），MCTY组中的甘氨酸含量显著降低（P0.05）。与MSR组相比，MCTY组的组氨酸含量显著降低（P0.05）。各处理组之间其他氨基酸含量差异不显著（P0.05）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.017.T003表3不同酵母菌发酵后象草氨基酸含量项目C组MSR组LCTY组MCTY组HCTY组CRY组天冬氨酸0.67±0.020.68±0.050.65±0.030.67±0.010.68±0.050.68±0.05苏氨酸0.34±0.010.35±0.030.33±0.020.34±0.010.35±0.030.35±0.02丝氨酸0.32±0.000.32±0.030.31±0.020.32±0.010.33±0.030.31±0.02谷氨酸0.76±0.020.77±0.050.75±0.030.77±0.010.79±0.050.78±0.05脯氨酸0.26±0.01b0.29±0.03ab0.27±0.01ab0.27±0.02ab0.29±0.05ab0.28±0.01a甘氨酸0.43±0.01a0.42±0.03ab0.43±0.02ab0.41±0.00b0.43±0.02ab0.42±0.02ab丙氨酸0.51±0.020.52±0.040.51±0.020.51±0.010.53±0.030.53±0.03半胱氨酸0.01±0.010.03±0.010.02±0.010.03±0.010.03±0.010.03±0.02缬氨酸0.45±0.020.49±0.030.46±0.020.46±0.010.49±0.040.49±0.03蛋氨酸0.13±0.040.12±0.060.11±0.030.10±0.030.13±0.050.12±0.05异亮氨酸0.41±0.020.43±0.030.41±0.020.41±0.010.44±0.020.43±0.05亮氨酸0.64±0.020.67±0.040.65±0.020.65±0.010.68±0.050.67±0.05络氨酸0.21±0.010.22±0.020.21±0.020.22±0.010.22±0.020.21±0.03苯丙氨酸0.35±0.010.38±0.030.35±0.010.35±0.010.37±0.040.36±0.03赖氨酸0.41±0.050.45±0.030.42±0.050.43±0.040.43±0.030.42±0.03组氨酸0.14±0.01ab0.15±0.01a0.14±0.01ab0.12±0.01b0.15±0.02ab0.13±0.02ab精氨酸0.31±0.010.31±0.040.30±0.000.30±0.020.32±0.040.33±0.03总氨基酸6.36±0.116.50±0.296.32±0.156.36±0.086.66±0.526.54±0.46%3讨论3.1经铜驯化后的酵母菌对象草pH值的影响在生物发酵工艺中，pH值是一个非常重要的发酵参数，发酵过程中酸含量的增加有利于饲料的长期保存[16]。结果表明，象草经厌氧发酵后，所有组的pH值偏酸性，可能是因为发酵菌种增殖过程中产生并积累大量的有机酸，导致发酵料pH值降低[17]，如在果酒、泡菜等的酿造发酵过程中，酵母菌能够迅速地将底物中的还原糖成分降解转化为酸类物质[18-20]。酵母菌本身产酸的能力有限，在象草发酵初期，酵母菌可将底物中的葡萄糖代谢产物丙酮酸转化为乳酸、乙酸或乙醇[21]，从而使象草发酵料pH值降低；在发酵后期，乙醇含量的不断升高，酵母菌细胞的生长受到抑制，切断了丙酮酸的代谢产酸途径，底物的pH值降低趋于稳定。MSR是成熟的青贮剂，是产朊假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌复合菌，具有良好的发酵效果。研究结果表明，发酵菌添加量为100 mg/kg的HCTY组pH值与发酵菌添加量为65 mg/kg的MSR组相近且低于其他组，说明HCTY的发酵效果与MSR相近，发酵效果良好。本研究中，C组pH值偏酸，可能是因为原料本身未被灭菌的乳酸菌在发酵过程中得到一定程度的增殖导致pH值降低[22]，而LCTY组、MCTY组、CRY组的pH值与C组相近，可能是因为LCTY组、MCTY组、CRY组酵母菌含量较低，虽然酵母菌增殖过程中产生的丙酮酸、琥珀酸等代谢产物能够促进乳酸菌的活动[22]，从而导致原来乳酸含量增高，pH值迅速降低[23]，但因添加的酵母菌的含量较低，其产生的酸不足以明显高于C组原本的乳酸菌产生的酸。说明酵母经高浓度铜驯化后，仍具有良好的发酵效果，其对象草较好的发酵添加量为100 mg/kg。在发酵过程中，酵母菌利用底物中的物质用于自身物质的合成。有研究表明，益生菌固态发酵过程中干物质损失量和生物量呈正相关[24]，尤其是马克斯克鲁维酵母菌[25]。本试验结果表明，与MSR组相比，LCTY组象草发酵后，干物质的含量显著升高，与热带假丝酵母发酵豆粕后期干物质含量升高的研究结果相一致[25]，可能是象草发酵过程中，LCTY添加含量较低，酵母菌有充足的养分和生长空间，加上与MSR的复合菌相比，LCTY组种间竞争压力较小，使得在发酵早期，酵母菌生长量的增长速度超过了发酵底料的消耗速度，而导致干物质含量升高。3.2经铜驯化后的酵母菌对象草营养成分的影响酵母菌的主要营养物质和能量来源于单糖，酵母菌能迅速地将底物中的还原糖转化为酯类、醇类和酸类物质[18-20]，获得营养和能量。但酵母菌对纤维等多糖的发酵能力有限，且对不同的底物纤维，发酵的能力也不同。酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母对玉米纤维的降解能力较强；而对大豆，豌豆和豆粕纤维的降解能力较弱，热带假丝酵母菌对豌豆纤维的降解能力较强；而对玉米、大豆、豆粕纤维的降解能力较弱[25]。试验结果表明，经铜驯化后的酵母菌对象草纤维的发酵能力有限，添加CTY和CRY后，象草粗纤维、无氮浸出物含量与C组相比无显著差异，说明高铜驯化不影响酵母菌对象草纤维的降解能力。在微生物发酵过程中，糖类等能量物质被优先利用于微生物自身的生长，从而间接导致发酵后粗蛋白，粗脂肪等营养物质的含量升高[26]。此外，酵母本身蛋白质含量为45%~60%，其在发酵过程中大量繁殖，提高发酵底物粗蛋白的含量[27-29]。因酵母菌对象草纤维的发酵能力有限，象草经CTY和CRY发酵后粗蛋白、粗脂肪和总氨基酸含量与C组相比无显著差异，与前人对单菌和复合菌发酵菜籽粕[30]、豆粕[31]、大豆、豌豆、玉米[25]导致粗蛋白，低分子肽含量升高的结果不同。微生物在生长代谢过程中消耗能量物质，使钙、磷等矿质元素在干物质中的比例相对提高[32]。在采用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母及其复合菌发酵棉粕的试验中，钙和磷的含量均有所提高，且枯草芽孢杆菌和酿酒酵母复合菌组钙和磷的含量极显著提高（P0.01）[33]。在基础饲粮中添加4%、8%、12%糖化玉米秸秆，糖化玉米秸秆钙的含量增加9.31倍[34]。使用浓度为70 mL/kg的枯草芽孢杆菌发酵棉粕，在温度为37 ℃、初水分为30%、初始pH值为7.0的条件下，发酵72 h后，棉粕发酵饲料中有效磷含量提高45.5%，差异极显著（P0.01）[32]。在动物饲料原料中，钙的含量过大，造成钙元素超过动物的营养需求，会对动物机体产生刺激，引起动物饮水量增加和腹泻等。本研究中，添加MSR、CTY及CRY发酵后，象草发酵料钙含量与C组相比，无显著差异，说明经铜驯化后酵母菌对钙的吸收和代谢影响不大，与以乳酸菌和地衣芽孢杆菌对全价饲料进行3 d厌氧发酵后，钙含量显著降低（P0.01）的研究结果不同[35]。此外，MCTY组和CRY组与C组和LCTY组相比，总磷的含量显著降低，与以乳酸菌和地衣芽孢杆菌对全价饲料进行3 d厌氧发酵后，总磷的含量显著降低（P0.01）的研究结果相似[35]。3.3经铜驯化后的酵母菌对象草氨基酸组成的影响酵母菌发酵的产物中含有大量的氨基酸。有研究表明，酵母单菌和酵母菌乳酸菌混菌对豆粕、玉米、麸皮组成的饲料进行发酵后，苯丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、丝氨酸的含量显著提高（P0.05），而且酵母单菌发酵后，饲料总氨基酸的含量显著提高（P0.05）[36]。研究表明，MSR组、CTY组、CRY组的发酵象草总氨基酸含量与C组相比无显著差异，与发酵后粗蛋白的含量变化不大相关。在特定的氨基酸中，与C组相比，MCTY组甘氨酸含量显著降低（P0.05），CRY组脯氨酸含量显著升高，说明经铜驯化后的酵母菌富集铜后，氨基酸的利用偏好发生改变，铜元素改变了酵母菌对氨基酸的利用偏好性。此外，与MSR组相比，MCTY组氨酸含量显著降低，说明与产朊假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌混菌相比，MCTY对组氨酸的利用率更高。这与黑曲霉菌发酵菜籽粕，使天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、苏氨酸和缬氨酸含量升高的结果不一致[30]。在总氨基酸含量不变的情况下，特定氨基酸含量降低，可能会导致此类发酵料在长期饲喂过程中养殖动物存在某种营养缺乏的风险。因此，应对酵母菌铜驯化的铜浓度，及驯化后酵母菌富铜的浓度和投放量做进一步的深入研究，以找到对酵母菌发酵象草影响最小的驯化铜浓度，铜富集浓度及投放量。酵母菌经铜驯化和富集铜后，对象草有较好的发酵效果，发酵后的象草颜色青黄、气味香甜、适口性好，可作为猪的饲料原料。4结论酵母菌可通过逐步提高培养液铜浓度的方式获得高的铜耐受特性和高的铜富集能力，且有对象草较好的发酵能力。富铜酵母菌发酵象草料可作为提供有机铜元素的猪的生态饲料，有利于减少生猪养殖排泄物中无机铜的环境污染，具有良好的发展前景。