乳腺组织作为分泌合成乳蛋白的重要场所，是奶牛体内代谢旺盛的组织之一，短时间内产生大量活性氧（ROS）、活性氮自由基，超高水平的ROS等自由基会导致乳腺内氧化还原失衡，产生氧化应激，进而破坏有机大分子发生代谢紊乱，诱导疾病产生[1]。维生素A（VA）在维持机体正常生理功能中起重要作用，通过对多种通路的调控氧化、刺激免疫、维持上皮细胞等功能[2]。过氧化氢（H2O2）通过消耗抗氧化物质降低抗氧化能力，进而导致细胞损伤[3-5]。因此，探讨VA缓解奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）氧化损伤以及乳蛋白合成下降的机理，对提高乳产量、乳品质具有重要意义。本课题组前期研究发现，与饲喂推荐剂量110 IU/kg BW组相比，饲喂高剂量的VA（220 IU/kg BW）可以显著提高奶牛血清中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性，并显著降低血清中ROS的含量，乳蛋白含量有增加的趋势[6]。体外试验研究发现，VA缓解脂多糖对BMECs的氧化损伤，提高细胞内GPX、TrxR的活性和基因表达。有研究在BMECs内添加VA，发现VA具有促进乳蛋白及其合成相关基因的表达的作用[7-8]。但VA能否通过缓解氧化应激促进乳蛋白的合成的研究较少。因此，本试验以H2O2诱导的BMECs为损伤模型，添加不同水平VA探究其对H2O2诱导损伤的BMECs内乳蛋白合成的影响及其机理，筛选适宜的VA添加剂量，为深入研究乳蛋白合成的调控机理提供参考。1材料与方法1.1细胞培养及试验设计原代BMECs的培养采用胶原酶消化法，参照Qi等[9]方法进行。本试验采取单因素完全随机试验设计，将贴壁的第三代BMECs随机分成9个处理组，对照组（CON组）不添加H2O2和VA，H2O2损伤组（H2O2组）生长培养基处理24 h，换含有H2O2的培养基继续培养6 h，H2O2损伤组+不同水平VA预保护组分别添加0.05（0.05HA组）、0.10（0.10HA组）、0.20（0.20HA组）、0.50（0.50HA组）、1.00（1.00HA组）、2.00（2.00HA组）、4.00 mg/L（4.00HA组）的VA，各VA预保护组只添加含相应水平VA的培养基处理24 h，再换含有H2O2、VA的培养基继续处理6 h，每组6个重复。各处理组置于5% CO2培养箱内，37 ℃培养30 h，收集培养液和细胞用于分析测定。H2O2质量浓度为800 μmol/L，参考课题组前期建立的损伤模型水平[5]。处理结束，收集细胞以及细胞培养液进行乳蛋白合成相关酶活及基因表达的测定。1.2试剂配制VA贮备液：50 mg的视黄酸（Sigma公司）溶解于2.5 mL二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司），配制成20 g/L的VA原液，0.22 μm滤器过滤后避光冷冻保存。H2O2贮备液：3% H2O2约为0.88 mol/L（880 mmol/L），使用超纯水将880 mmol/L的H2O2原液稀释成800 mmol/L的贮备液，工作液的配制均现用先配。1.3测定指标及方法1.3.1乳蛋白合成相关酶活BMECs调整为3×105个/mL的密度接种于60 mm内，根据试验设计添加不同工作液处理30 h，细胞置于冰上，弃去剩余细胞上清，PBS清洗，加入适量细胞裂解液，冰浴30 min，刮取细胞转入1.5 mL Eppendorf离心管内，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清，用于测定细胞内酶活。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）αs1-酪蛋白（CSN1S1）、β-酪蛋白（CSN2）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的含量和p70核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）活性，按照试剂盒说明书进行。1.3.2抗氧化酶和乳蛋白合成相关的基因表达BMECs调整为2×105个/mL的密度接种于6孔板内，根据试验设计进行处理30 h，使用Trizol法提取细胞内的总RNA[10]，RNA反转录使用PrimeScript RT reagent Kit（Takala）试剂盒并按说明书进行操作。利用ABI-7500实时荧光定量PCR仪（ABI公司）测定其在细胞内的相对表达量，详细步骤参照SYBY Premix Ex TaqTM Ⅱ（Takala）试剂盒说明书。以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参基因。用2－△△Ct法计算表达量，引物序列见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.013.T001表1引物序列项目GenBank登录号引物序列（5'→3'）长度/pb磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）XM_001252479F：GGGTCATCATCTCTGCACCT177R：GGTCATAAGTCCCTCCACGA续表1　引物序列10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.013.T002项目GenBank登录号引物序列（5'→3'）长度/pbαs1-酪蛋白（CSN1S1）NM_181029F：ACATCCTATCAAGCACCAAGGACTC192R：GACGAAATGCTTTCAGCTTCCAβ-酪蛋白（CSN2）M-64755.1F：TCTGCCTCTGCTCCAGTCTT116R：AGGAGGGGGCATTCACTTTk-酪蛋白（CSN3）NM_174294F：CCAGGAGCAAAACCAAGAAC148R：TGCAACTGGTTTCTGTTGGT真核起始因子4E（eIF4E）NM_174310.3F：GAAGACTTTTGGGCTCTGTAC82R：CAGCTCCACATACATCATCAC真核起始因子4E结合蛋白1（4EBP1）BC120290F：GGCAGGCGGTGAAGAGTC302R：CCTGGGCTGCGGGAT雷帕霉素靶蛋白（mTOR）XM_001788228F：TGAACTGGAGGCTGATGGACAC83R：TGACTGGCCAGCAGAGTAGGAAp70核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）DN544771F：CAAGCTTGCATGCTAATTTGTCC101R：TTGAGTCCTGATCATGTCGAAGA酪氨酸激酶2（JAK2）DT897449F：TGAAGAAAACAGGTAATCAGACTGGA101R：AACATTTTCTCGCTCAACAGCA信号转导和转录激活因子5（STAT5）NM_001012673F：AAGACCCAGACCAAGTTCGC422R：AGCACCGTGGCAGTAGCAT1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2019软件进行整理，SAS 9.0软件进行单因素方差分析。结果以“平均值和总标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1VA对H2O2诱导损伤的BMECs内乳蛋白、mTOR含量与S6K1活性的影响（见表2）由表2可知，与CON组相比，H2O2组CSN1S1、CSN2、mTOR的含量显著降低（P0.05）。与H2O2组相比，0.50HA组~4.00HA组CSN1S1、CSN2的含量显著升高（P0.05）；2.00HA组mTOR含量显著升高（P0.05）；1.00HA组~4.00HA组S6K1的酶活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.013.T003表2VA对H2O2诱导损伤的BMECs内乳蛋白、mTOR含量与S6K1活性的影响项目CSN1S1/(mg/L)CSN2/(mg/L)mTOR/(μg/L)S6K1/(U/L)CON组79.77abc41.23ab14.09ab1.46bH2O2组61.08d27.99c12.17c1.30b0.05HA组69.37cd28.83c12.29c1.33b0.10HA组69.69cd34.62bc12.63bc1.40b0.20HA组72.62cd36.55b13.12bc1.47b0.50HA组74.08bc41.84ab12.77bc1.48b1.00HA组86.11a46.58a13.22bc1.88a2.00HA组89.45a41.87ab15.03a1.80a4.00HA组84.73ab40.12ab12.57c1.83aSEM3.412.110.510.10P值0.0010.0010.0030.001注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2VA对H2O2诱导损伤的BMECs内乳蛋白、mTOR与JAK-STAT信号通路相关基因表达的影响（见表3）由表3可知，与CON组相比，H2O2组CSN1S1、mTOR、eIF4E、JAK2、STAT5的基因表达显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.013.T004表3VA对H2O2诱导损伤的BMECs内乳蛋白、mTOR与JAK-STAT信号通路相关基因表达的影响项目CSN1S1CSN2CSN3mTORS6K1eIF4E4EBP1JAK2STAT5CON组1.00c1.00bc1.00de1.00bc1.00cd1.00d1.00bc1.00c1.00bcH2O2组0.81d0.86c0.88e0.77d0.85d0.75e0.81c0.83d0.66g0.05HA组0.95cd0.98bc1.04cde0.87cd1.21bc1.22c1.00bc1.02c0.69fg0.10HA组1.03c0.98bc1.22bcd0.92cd1.22bc1.30c1.33b1.14bc0.77ef0.20HA组1.26b1.21ab1.27bcd0.97c1.17c1.29c1.16bc1.23b0.81de0.50HA组1.42ab1.33a1.38b0.90cd1.04cd1.28c1.12bc1.08bc1.01b1.00HA组1.46a1.44a1.95a1.04bc1.41ab1.57b1.36b1.17bc1.17a2.00HA组1.40ab1.37a1.29bc1.17ab1.44ab1.79a2.26a1.54a0.97bc4.00HA组1.28b1.35a1.25bcd1.24a1.63a1.50b2.16a1.53a0.90cdSEM0.0490.0880.0740.0580.0750.0510.1160.0530.029P值0.0010.0030.0010.0010.0010.0010.0010.0010.001与H2O2组相比，各VA预处理组eIF4E的基因表达显著升高（P0.05），以2.00HA组最高；0.10HA组~4.00HA组CSN1S1、CSN3、STAT5的基因表达显著升高（P0.05），0.50HA组~2.00HA组CSN1S1基因表达量较高，1.00HA组CSN3、STAT5基因表达量最高；0.20HA组~4.00HA组CSN2的基因表达显著升高（P0.05）；0.20HA组、1.00HA组~4.00HA组mTOR的基因表达显著升高（P0.05），以2.00HA组和4.00HA组较高；1.00HA组~4.00HA组S6K1、4EBP1的基因表达显著升高（P0.05）。3讨论乳中的蛋白主要是酪蛋白，如CSN1S1、CSN2、CSN3，三者是衡量牛奶中乳蛋白含量的重要指标，与酪蛋白指数和乳蛋白的产生有关[11]。本试验中，H2O2诱导损伤BMECs后，CSN1S1、CSN2、mTOR的含量和mTOR、eIF4E、JAK2、STAT5基因表达显著降低。研究表明，乳蛋白的合成主要是在转录和翻译两方面通过mTOR信号通路和JAK2/STAT5信号通路调节。Nan等[12]和赵艳丽等[10]分别在乳腺细胞和BMECs内添加赖氨酸和蛋氨酸以及单独添加蛋氨酸，结果发现，二者均可增加细胞内CSN1S1、CSN2、CSN3、JAK2、STAT5和mTOR的基因表达量。研究发现，在抑制BMECs中STAT5基因后，显著降低了酪蛋白的基因表达[13]。刘立新[14]研究发现，氧化损伤BMECs后可显著降低mTOR、STAT5、S6K1和4EBP1的基因表达量。本试验结果表明，H2O2损伤BMECs后显著降低了CSN1S1、CSN2含量、CSN1S1基因表达、mTOR含量及通路相关基因eIF4E、JAK2、STAT5通路相关基因表达。乳腺组织是泌乳的关键主要场所，代谢旺盛易发生氧化应激。TrxR、GPX等酶是清除体内自由基的重要物质，活性升高能够缓解自由基堆积引起的氧化应激[15-16]。体内外试验研究表明，奶牛日粮中添加高于推荐剂量VA（220 IU/kg BW）可明显提高免疫和抗氧化能力，具有提高乳蛋白含量的趋势[6]；培养BMECs时添加VA，可通过提高TrxR、GPX等酶的活性，减少ROS的含量缓解氧化应激[17]。H2O2损伤人体肝细胞及BMECs后，细胞内GPx1、CAT和SOD的活性显著降低，ROS含量增加[18-19]；添加VA预保护后可缓解H2O2引起的抗氧化酶活力的下降，抑制ROS的生成[20]。研究发现，培养奶牛乳腺上皮细胞时添加视黄酸促进了TrxR的基因表达[8]；VA通过提高LPS诱导损伤的BMECs内GPx和TrxR mRNA表达，抑制自由基生成，进而缓解细胞的损伤[21]。本课题组前期研究结果显示，添加VA能够缓解H2O2损伤BMECs引起的RGR、抗氧化酶活GPx1和TrxR的基因表达的下降，ROS含量的显著增加[20]。苏芮[22]发现，添加VA可显著升高BMECs内mTOR信号通路相关基因与乳蛋白基因CSN1S1和CSN3的基因表达量，促进乳蛋白的合成。Hu等[23]研究发现，培养小鼠骨髓间充质干细胞时敲除GPX7基因，mTOR信号通路相关因子P70S6K1和磷酸化P70S6K1的蛋白表达显著降低。研究表明，JAK/STAT通路能够调控炎症，葛根芩连汤可通过JAK/STAT通路降低ROS和其他炎症因子，缓解小鼠结肠上皮的氧化应激[24]。研究表明，添加VA预保护能够缓解H2O2诱导损伤的BMECs内乳蛋白合成下降，可能是通过上调抗氧化酶活性以及TRxR、GPX的基因表达，进一步调控JAK/STAT和mTOR通路相关基因的表达，达到调控乳蛋白合成的作用。目前相关报道较少，仍有待进一步深入探究。4结论本研究结果表明，VA可缓解H2O2引起的BMECs乳蛋白合成基因CSN1S1、CSN2、CSN3以及乳蛋白合成相关的STAT5、JAK2、mTOR、S6K1、eIF4E、4EBP1的表达下降。以0.20HA组~4.00HA组较好，尤以添加1 mg/L VA对H2O2诱导损伤的BMEC内蛋白下降的缓解作用最好。