牡丹为芍药科芍药属多年生落叶灌木植物，原产地中国，为我国特有的木本名贵花卉[1-2]，具有明显的资源优势[3-4]。目前，关于牡丹的研究和应用多集中于牡丹花、牡丹籽和牡丹皮，对牡丹叶的研究与利用较少。牡丹叶不仅产量大，资源丰富，还具有较高的营养价值和食用价值。随着牡丹产业不断扩大，牡丹叶的开发利用也逐渐得到重视，牡丹叶中含有丰富的黄酮类、酚类、单萜类等成分[5-7]，具有良好的免疫调节、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用[8-9]，植物源黄酮化合物在促进动物生长[10]、提高机体免疫[11]方面具有良好的效果。有研究表明，将牡丹叶开发成牡丹饲料添加剂能够提高蛋鸡的抗病能力及存活率，促进蛋鸡生长，降低蛋鸡死亡率，提高产蛋率[12]，改善禽畜场生态环境[13]。不同品种的牡丹叶其营养和功能成分可能存在差异，直接影响牡丹叶相关产品的开发。为开发利用牡丹叶资源，提升牡丹叶作为新型饲料添加剂的应用，本研究采集河南洛阳产地种植面积较大的20个不同品种的牡丹叶，选择总黄酮、总酚和芍药苷作为指标成分，评价不同品种牡丹叶的抗氧化活性（DPPH自由基、ABTS自由基清除试验）；通过相关系数法，研究主要物质成分和抗氧化活性的相关性，采用主成分分析法（PCA）对不同品种牡丹叶聚类评价，以期为牡丹叶品质评价、资源利用和抗氧化添加剂产品的开发提供参考。1材料与方法1.1试验材料对照品：没食子酸（批号：110831-201906，纯度91.5%）、芍药苷（批号：110736-202145，纯度94.6%）、芦丁（批号：100080-202012，纯度92.2%）由中国食品药品检定研究院提供。试剂：色谱乙腈购自赛默飞世尔公司，甲醇、无水乙醇、甲酸均为分析纯购自北京化工厂，亚硝酸钠、硝酸铝购自天津市致远化学试剂有限公司，无水碳酸钠、氢氧化钠、高硫酸钾（K2S2O8）购自北京化工厂，DPPH购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司，ABTS购自上海麦克林生化有限公司，福林酚购自Sigma公司，VC购自天津恒兴化学试剂制造有限公司。材料：采集洛阳孟津种植基地牡丹叶共20个品种，信息见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.016.T001表120个洛阳牡丹叶品种信息编号品种采集时间编号品种采集时间S1香玉2021.4S11御衣黄2021.4S2丹凤2021.4S12黄冠2021.4S3雪塔2021.4S13洛阳红2021.4S4景玉2021.4S14脂红2021.4S5肉芙蓉2021.4S15飞来红2021.4S6赵粉2021.4S16首案红2021.4S7建始粉2021.4S17今紫2021.4S8银鳞碧珠2021.4S18紫光阁2021.4S9姚黄2021.4S19旭港2021.4S10海黄2021.4S20紫蓝魁2021.4采集的牡丹叶样品于电热恒温干燥箱内，50 ℃干燥24 h。1.2仪器设备Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪、TU-1810紫外分光光度计购自北京普析，美国Molecular Device M2型酶标仪、AUW 220D电子分析天平、ME204电子分析天平、KQ-500E超声清洗仪、DHG-9055A电热恒温干燥箱、永历114摇摆式高速中药粉碎机。1.3测定指标及方法1.3.1样品溶液制备牡丹叶打粉，过3号筛。精密称定牡丹叶粉末4.0 g，置于三角瓶中，加入80%乙醇溶液100 mL，超声30 min，称重，80%乙醇补足重量，过滤，取续滤液。1.3.2总黄酮含量1.3.2.1芦丁标准曲线的绘制总黄酮的测定方法参考文献[14]和文献[15]中方法并作改进。精密称量芦丁对照品5.20 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解并制成1 mL含量为0.208 mg的芦丁对照品储备液。精密量取对照品储备液2、3、4、5、6 mL，分别置25 mL量瓶中，加水至6 mL，加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加入10%的硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加入4%氢氧化钠溶液10 mL，加水至刻度，摇匀，放置10 min，510 nm处测定其吸光度，空白试剂作参比。以吸光度为纵坐标，芦丁质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：y=0.0116x-0.0126，R²=0.999 1。1.3.2.2样品中总黄酮含量取不同批次牡丹叶样品，按1.3.1方法制备溶液，1.3.2.1方法测定，各试验均重复测定3次，据线性回归方程，计算各样品的含量。1.3.3总酚含量测定1.3.3.1总酚标准曲线绘制总酚的测定方法参考文献[16]至文献[18]中方法并作改进。精密称量没食子酸对照品2.51 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解并制成1 mL含量为0.100 4 mg的没食子酸对照品储备液。精密量取对照品储备液1、2、3、4、5 mL，分别置于100 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，得没食子酸的系列对照品溶液。精密量取系列对照品溶液各1 mL，分别置于10 mL量瓶中，加入0.5 mL福林酚，摇匀，反应5 min，加入2 mL 7.5% NaCO3，纯化水定容至刻度，避光反应30 min，765 nm处测定吸光度，空白试剂作参比，以吸光度为纵坐标，总酚质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，线性回归方程：y=0.106 3x+0.008 2，R²=0.999 3。1.3.3.2样品中总酚含量取不同批次牡丹叶样品，按1.3.1方法制备溶液，1.3.3.1方法测定，各试验均重复测定3次，据线性回归方程计算各样品的含量。1.3.4芍药苷含量测定1.3.4.1色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脱：0~8 min，A 5%，B 95%；8~15 min，A 5%~15%，B 95%~85%；15~16 min，A 15%~18%，B 85%~82%；16~35 min，A 18%，B 82%；35~40 min，A 18%~25%，B 82%~75%；40~55 min，A 25%，B 75%；55~58 min，A 25%~32%，B 75%~68%；58~63 min，A 32%~80%，B 68%~20%。检测波长为230 nm，流速为1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL。1.3.4.2芍药苷标准曲线绘制精密称定芍药苷对照品3.86 mg，置于5 mL量瓶中，甲醇溶解并制成1 mL含量为0.732 2 mg的芍药苷对照品储备液。精密量取对照品储备液0.5、1.0、1.0、0.5、1 mL，分别置于20、20、10、2、2 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，得芍药苷的系列对照品溶液。精密吸取系列对照品溶液各10 μL，分别进样，记录色谱图，以对照品的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：y=12.57x-32.044，R2=1.000 0。1.3.4.3样品中芍药苷含量取不同批次牡丹叶样品，按1.3.1方法制备溶液，滤液过0.22 μm微孔滤膜，各试验均重复测定3次，根据外标法计算各样品的含量。1.3.5抗氧化活性测定1.3.5.1DPPH自由基清除试验DPPH溶液的配制：精密称取DPPH 4.02 mg，于50 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解，定容，摇匀，制得0.080 4 g/L的DPPH溶液。DPPH清除率的测定：测定方法参考文献[19]和文献[20]的方法并加以改进。按1.3.1方法制备样品溶液，分别配制成系列浓度的溶液。取各样品溶液100 μL于96孔板，加入0.080 4 g/L的DPPH溶液100 μL，充分混匀，室温避光放置30 min，于517 nm波长处测吸光度，以甲醇为空白对照，VC为阳性对照；各组试验均重复测定3次，计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率=[1-(A-B)/A0]×100%(1)式中：A为100 μL样品+100 μL DPPH溶液的吸光度；B为100 μL样品+100 μL甲醇的吸光度；A0为100 μL甲醇+100 μL DPPH溶液的吸光度。1.3.5.2ABTS自由基清除试验ABTS溶液的配制：精密称取ABTS 50.15 mg于10 mL容量瓶中，加纯化水溶解，定容，摇匀；临用前加入200 μL 1 g/L的K2S2O8水溶液，充分混匀，避光放置16 h。ABTS清除率的测定：测定方法参考文献[20]和文献[21]的方法并加以改进。按1.3.1方法制备样品溶液，分别配制成系列质量浓度的溶液。取各样品溶液20 μL于96孔板，加入ABTS溶液200 μL，充分混匀，室温避光放置30 min，于734 nm波长处测吸光度，以甲醇为空白对照，VC为阳性对照；各组试验均重复测定3次，计算ABTS自由基清除率。ABTS自由基清除率=[1-(A-B)/A0]×100%(2)式中：A为20 μL样品+200 μL ABTS溶液的吸光度；B为20 μL样品+200 μL甲醇的吸光度；A0为20 μL甲醇+200 μL ABTS溶液的吸光度。2结果与分析2.1牡丹叶总黄酮含量测定结果（见表2）由表2可知，不同批次牡丹叶总黄酮含量范围为20.71~54.03 mg/g。姚黄（S9）中总黄酮含量最高，为54.03 mg/g，其次是海黄（S10），为53.39 mg/g。金紫（S17）、紫光阁（S18）和紫蓝魁（S20）的总黄酮含量较低，分别为20.80、20.71、21.52 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.016.T002表2牡丹叶总黄酮含量测定结果样品总黄酮含量样品总黄酮含量样品总黄酮含量样品总黄酮含量S137.81±1.48gS630.17±1.12deS1145.35±1.49iS1622.91±0.96bcS234.56±0.62fS731.83±0.83eS1242.80±0.95hS1720.80±1.06aS335.22±1.20fS828.71±0.71dS1322.48±2.07abcS1820.71±1.22aS436.08±0.82fS954.03±0.52jS1424.07±0.92cS1922.18±0.92abcS529.43±0.85dS1053.39±1.20jS1522.79±1.73bcS2021.52±1.16ab注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mg/g2.2牡丹叶总酚含量测定结果（见表3）由表3可知，不同批次牡丹叶总酚含量范围为68.31~188.19 mg/g。海黄（S10）中总酚含量最高，为188.19 mg/g，显著高于姚黄（S9）（P0.05）。洛阳红（S13）、脂红（S14）和飞来红（S15）的总酚含量较低，分别为71.35、72.44、71.54 mg/g（P0.05）；金紫（S17）的含量最低，为68.31 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.016.T003表3牡丹叶总酚含量测定结果样品总酚含量样品总酚含量样品总酚含量样品总酚含量S1150.57±1.16kS695.27±0.99fS11162.97±1.66mS1673.83±1.75cS2143.30±1.14jS7126.59±0.93hS12153.79±1.50lS1768.31±1.24aS3138.58±1.03iS8109.81±0.56gS1371.35±1.41bcS1870.75±2.94abS4124.58±2.72hS9163.73±0.92mS1472.44±2.31bcS1977.02±1.73dS591.35±1.12eS10188.19±2.24nS1571.54±1.16bcS2076.89±1.62dmg/g2.3芍药苷含量测定结果牡丹叶芍药苷含量测定结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.016.T004表4牡丹叶芍药苷含量测定结果样品芍药苷含量样品芍药苷含量样品芍药苷含量样品芍药苷含量S130.22±1.01fS626.61±0.64deS1139.70±0.55iS1626.29±0.51deS226.10±0.98deS722.07±0.78bS1241.82±0.45jS1725.66±0.53dS336.87±0.91hS820.50±0.89aS1332.86±0.83gS1824.34±0.44cS435.84±0.66hS942.97±0.52jS1424.22±0.43cS1924.38±0.49cS527.21±1.02eS1045.10±0.83kS1523.67±0.71cS2024.04±0.66cmg/g对照品溶液的HPLC色谱图见图1，样品（S1）溶液的HPLC色谱图见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.016.F001图1对照品的HPLC色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.016.F002图2样品（S1）的HPLC色谱图由表4可知，不同批次牡丹叶芍药苷含量范围为20.50~45.10 mg/g。海黄（S10）中芍药苷含量最高，为45.10 mg/g，显著高于姚黄（S9）（P0.05）。飞来红（S15）的芍药苷含量较低，显著高于建始粉（S7）（P0.05）；银鳞碧珠（S8）的芍药苷含量最低，为20.50 mg/g。2.4抗氧化活性测定结果2.4.1DPPH自由基清除活性测定结果以各样品溶液的质量浓度为横坐标（x），DPPH清除率为纵坐标（y），绘制标准曲线，得到各样品的线性回归方程和EC50值，见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.016.T005表5牡丹叶对DPPH自由基清除率线性回归方程和EC50值样品标准曲线线性范围/(mg/L)R2EC50/(mg/L)S1y=2.451x+4.2025.005~40.0400.955 318.76±1.53bS2y=2.237x+3.2835.015~40.1200.971 520.21±0.67bS3y=2.323x+3.1785.000~40.0000.916 519.73±2.24bS4y=2.312x+4.2755.035~40.2800.891 719.28±1.21bS5y=1.638x+4.88510.02~60.120.925 227.31±0.95cS6y=1.677x+6.95310.05~60.300.914 425.24±1.26cS7y=1.602x+7.11310.07~60.420.931 926.11±0.80cS8y=1.761x-2.62310.10~60.600.907 128.67±1.37cS9y=3.665x+10.6402.515~25.1500.871 710.29±0.91aS10y=3.722x+11.3702.503~25.0300.852 29.53±0.65aS11y=3.595x+8.4452.530~25.3000.869 711.20±0.84aS12y=3.682x+8.0312.508~25.0800.828 310.86±1.22aS13y=1.462x-22.5920.18~80.720.917 652.22±3.73deS14y=1.429x-23.6220.10~80.400.917 750.67±2.40dS15y=1.393x-24.2820.04~80.160.920 453.14±1.94deS16y=1.336x-22.7320.14~80.560.916 454.71±3.71eS17y=0.903 9x-19.3430.42~121.70.891 275.45±4.64fS18y=0.901 5x-22.0130.03~120.10.853 780.40±2.29gS19y=0.898 3x-17.2630.00~120.00.885 674.63±2.83fS20y=0.861 0x-23.8830.39~121.60.833 986.74±1.45hVCy=2.835x+27.721.004~25.1000.817 67.75±0.35由表5可知，不同批次牡丹叶提取液对DPPH自由基具有良好的清除作用，EC50值范围为9.53~86.74 mg/L，海黄（S10）对DPPH自由基清除能力最高，之后依次为姚黄（S9）、黄冠（S12）、御衣黄（S11），且4个品种间差异不显著（P0.05）；紫蓝魁（S20）对DPPH自由基的清除能力最低，各批次牡丹叶提取液的清除能力均低于VC。2.4.2ABTS自由基清除活性测定结果以各样品溶液的质量浓度为横坐标（x），ABTS清除率为纵坐标（y），绘制标准曲线，得到各样品的线性回归方程和EC50值，见表6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.016.T006表6牡丹叶对ABTS自由基清除率线性回归方程和EC50值样品标准曲线线性范围/(mg/L)R2EC50/(mg/L)S1y=0.898 0x+10.1310.13~81.040.913 544.15±0.99bS2y=0.950 3x+7.8299.890~79.1200.878 945.20±2.21bS3y=0.916 1x+6.24810.09~80.720.902 146.35±1.90bS4y=0.889 9x+8.9339.940~79.5200.861 547.18±1.10bS5y=0.951 0x-3.2489.900~79.2000.923 857.19±2.46cdS6y=0.910 1x-4.88110.15~81.200.904 659.80±2.52dS7y=0.956 0x-1.79110.10~80.800.913 254.34±3.87cS8y=0.968 2x-3.3829.920~79.3200.869 555.12±2.72cS9y=1.492x+8.03310.08~60.480.957 428.35±1.60aS10y=1.467x+9.1859.960~59.7600.940 226.77±2.51aS11y=1.424x+9.81410.05~60.300.912 827.64±0.73aS12y=1.453x+8.5879.940~59.6400.922 328.28±1.39aS13y=0.868 8x-25.8650.15~120.400.941 187.22±3.38eS14y=0.797 3x-23.1649.55~118.900.939 992.90±3.15fS15y=0.853 4x-28.4150.70~121.700.950 990.97±2.84fS16y=0.883 5x-26.4649.50~118.800.923 986.69±2.63eS17y=0.702 2x-42.5763.30~160.800.844 1133.50±2.24hS18y=0.660 8x-39.4160.72~161.900.906 2135.30±3.07hS19y=0.697 9x-39.0959.82~159.500.918 5129.90±3.65gS20y=0.648 3x-36.3061.20~163.200.925 5133.20±4.23hVCy=1.965 0x+20.215.010~40.0800.964 315.31±0.48由表6可知，不同批次牡丹叶提取液对ABTS自由基具有良好的清除作用，EC50值范围为26.77~135.30 mg/L，海黄（S10）对ABTS自由的清除能力最高，紫光阁（S18）最低；各批次牡丹叶提取液对ABTS自由基的清除能力均低于VC。2.5相关性分析结果分别将20批牡丹叶的主要成分含量及体外抗氧化EC50值导入TBtools软件进行相关性分析，结果见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.016.F003图3牡丹叶主要成分与抗氧化活性相关性由图3可知，总黄酮、总酚、芍药苷含量间成正相关，相关系数为0.753~0.954；DPPH自由基和ABTS自由基清除活性呈明显的正相关（P0.05），相关系数为0.992；DPPH自由基清除率EC50值与总黄酮、总酚、芍药苷含量存在明显的负相关（P0.05），相关系数分别为-0.845、-0.856和-0.631；ABTS自由基清除率EC50值与总黄酮、总酚、芍药苷含量也存在明显的负相关（P0.05），相关系数为-0.855、-0.863和-0.649。结果表明，牡丹叶中总黄酮、总酚、芍药苷3种成分可作为评价其抗氧化活性的指标，总酚的含量与抗氧化性紧密相关，总黄酮次之，芍药苷相关系数稍低。2.6主成分分析结果分别将20批牡丹叶的主要成分含量及体外抗氧化EC50值导入SPSS软件进行主成分分析，二维图见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.016.F004图420批牡丹叶的主成分分析结果由图4可知，PC1、PC2累积贡献率达95.95%，20批样品可聚为4类，其中S3、S4、S9、S10、S11和S12聚为第一类，S1、S2、S5、S6、S7和S8聚为第二类，S13、S17、S18、S19和S20聚为第三类，S13、S14、S15和S16聚为第四类。主成分分析结果表明，所研究品种按花色系不同存在一定的聚类，近似花色品种聚类有交集。相关指标综合结果较高的品种均集中在第一类，其中S9~S12为黄色花株样品，S3、S4为白色花株样品；第二类S5~S8为粉色花株样品，S1、S2为白色花株样品；第三类S17~S20为紫色花株样品；第四类S13~S16为红色花株样品，其中S13也可归集于第三类。3讨论本研究测定了20个不同品种牡丹叶样品抗氧化成分及体外抗氧化活性，结果表明，20个样品的总黄酮含量在20.71~54.03 mg/g，总酚含量在68.31~188.19 mg/g，芍药苷含量在20.50~45.10 mg/g，海黄（S10）和姚黄（S9）品种中3种成分的含量均较高；通过DPPH和ABTS自由基清除试验比较不同品种样品的体外抗氧化活性，结果表明，两种抗氧化能力结果基本一致，海黄（S10）的DPPH、ABTS自由基清除能力均较强，DPPH自由基清除率的EC50值达9.53 mg/L，ABTS自由基清除率的EC50值达26.77 mg/L，其次是姚黄（S9），表明海黄（S10）和姚黄（S9）的抗氧化能力强于其余品种，与该品种牡丹叶中含丰富的酚类、黄酮类、芍药苷成分密切相关。本试验中相关性分析发现，3种成分的含量与DPPH自由基和ABTS自由基清除能力均存在显著负相关（双尾0.01级别），相关系数较高（相关系数0.6），相关性顺序为总酚总黄酮芍药苷。张岩松等[22]研究发现，牡丹花提取物和牡丹叶提取物均具有较好抗氧化功效，且牡丹叶提取物活性优于牡丹花提取物活性。李佩璇等[17]研究发现，丹凤牡丹叶的提取液对DPPH自由基具有较好的清除作用。本试验中主成分分析能够将20个品种牡丹叶很好地聚类划分，说明主成分分析作为分类方法的可行性。不同品种间的活性成分与亲缘关系存在一定联系，由结果可知，亲缘关系较近时常含有含量相似或相同的物质成分。本研究中第一类相关指标综合结果最好，为黄色~白色花株样品，且黄色最为突出；粉色~白色系相关指标次之，聚为第二类，提示浅色系植株的叶资源部位的潜在利用价值。本研究的样品集中采集于洛阳产地，存在地域局限性，进一步研究将收集全国范围大宗产地的不同品种牡丹叶样品，以抗氧化成分为指标探索优质品种资源选育，为天然植物资源的有效利用提供参考。4结论本试验结果显示，不同品种牡丹叶的抗氧化能力有所差异，抗氧化功效与叶中活性物质总酚、总黄酮和芍药苷的含量呈正相关，相关顺序为总酚总黄酮芍药苷；借助主成分分析法探究不同品种来源的牡丹叶间差异，显示按花株色系差异存在一定的聚类，浅色系综合结果高于深色系。本研究结果可为牡丹叶作为天然抗氧化活性物质提供参考，为饲料新资源开发提供新思路。