辛夷为中国特有的药食同源性植物，主要分布在云南、福建、湖北等地，是木兰科木兰亚族木兰属植物紫玉兰、望春花干燥的花蕾，具有祛风发散、通鼻窍的功效[1]。黄酮类化合物是辛夷中主要有效成分[2-3]，具有抗氧化[4]、抗菌[5]、抗衰老和调节血压等活性功能。研究表明，辛夷黄酮能够增强动物的免疫力，提高动物繁殖、泌乳和生长性能，改善胴体品质[6-8]。黄酮类化合物主要提取方法有溶碱提酸沉法[9]、微波炉辅助提取法[10]、超声辅助提取法[11]、超临界提取法[12]及双水相系统提取法[13]。目前，辛夷总黄酮提取工艺研究主要有索氏提取法[14]、回流提取法[15]、超声波提取[16-17]。双水相系统是天然产物活性成分提取的一种理想技术，基于总黄酮在醇盐两相中存在分配差异而被分离[18]。超声双水相法具有操作简单、提取率高相、提取成本低等优点，但采用该方法提取辛夷总黄酮鲜见报道。本试验采用超声辅助双水相系统提取辛夷中总黄酮，研究辛夷总黄酮的抗氧化能力，以期为辛夷黄酮类开发利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料辛夷于2020年9月采集自河南省南召县，由新乡医学院药学院中药学教研室薛金涛鉴定为木兰科木兰属植物望春花（Magnolia biondii Pamp.）干燥花蕾；芦丁对照品（批号：100080-201408，纯度≥98%）由中国食品药品检定研究院提供；NaNO2、KCl、PEG1000、硫酸铵、NaOH试剂均为分析纯。FA2004电子分析天平购自上海双旭电子有限公司，UV2450岛津紫外可见分光光度计购自青岛聚创环保集团有限公司。1.2试验方法1.2.1双水相系统选择按照变量梯度将40%的PEG1000和40%的硫酸铵溶液的体积比分别设为9∶1、8∶2、7∶3、6∶1、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9使用两相溶液混合（总体积为10 mL），置于刻度试管中，振荡摇匀，静止30 min，观察两相的分层情况，记录上相和下相体积比。当硫酸铵溶液和PEG1000的体积比为5∶5时，静止后两溶液的体积比为1∶1，因此选用PEG1000溶液和硫酸铵溶液5∶5的体积比。1.2.2辛夷总黄酮提取称取预处理过的辛夷粉1 g，按照液料比加入一定水平的PEG1000和硫酸铵配制成的双水相系统，置于一定温度、功率的超声波清洗器中，提取一定时间取出，过滤，滤液转移至50 mL的具塞量筒中，静置，记录上下相的体积，分别取上相0.1 mL、下相1 mL于10 mL容量瓶中，参考秦晶晶等[4]的方法测定A值，计算总黄酮得率[18]。Y'=(C×V×D)/m×100%(1)式中：Y'为超声辅助下双水相系统提取辛夷总黄酮的得率（%）；C为双水相系统总黄酮的质量浓度，D为样品的稀释倍数；m为称取辛夷粉末的质量（g）。1.2.3芦丁标准曲线的绘制精密量取芦丁对照品溶液，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定不同质量浓度芦丁对照品溶液在510 nm处测定吸光度值，得到芦丁质量浓度与吸光度的线性回归方程为y=0.012 3x-0.070 9，R2=0.999 7。1.2.4单因素试验固定PEG1000质量分数40%，硫酸铵质量分数为30%，液料比40 mL/g，提取时间30 min，分别考察PEG1000质量分数（20%、25%、30%、35%、40%、50%）、硫酸铵质量分数（24%、26%、30%、32%、35%、40%）、液料比（20、30、40、50、60、70 mL/g）和提取时间（5、10、20、30、40、50 min）对辛夷总黄酮得率的影响。1.2.5响应面试验设计（见表1）辛夷总黄酮提取工艺的响应面试验采取Design Expert 8.0.6软件设计，以总黄酮得率为检测指标，选择PEG1000（A）、硫酸铵（B）、液料比（C）、提取时间（D）进行4因素3水平试验设计。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.019.T001表1响应面试验因素水平水平A/%B/%C/(mL/g)D/min-1352835200403040301453245401.2.6DPPH自由基清除能力的测定取所获得辛夷总黄酮提取液，并加无水乙醇配制质量浓度分别为0.005、0.010、0.020、0.030、0.040、0.050 g/L的样品溶液，参考秦晶晶等[4]的方法，以相应质量浓度的维生素C（VC）作为对比，计算DPPH自由基清除率。1.3数据统计与分析试验所有数据3次平行，采用Microsoft Excel 2010软件进行处理，SPSS 20.0软件进行分析，Design Expert 8.0.6软件进行绘图。2结果与分析2.1单因素试验结果（见图1~图4）2.1.1PEG1000质量分数对辛夷总黄酮得率的影响（见图1）由图1可知，当PEG1000质量分数小于40%时，总黄酮得率随着PEG1000增加逐渐增加；PEG1000质量分数为40%时，总黄酮得率最高，为2.01%；当PEG1000大于40%时，总黄酮得率随着PEG1000增加而逐渐减小。原因可能是随着双水相系统中上相醇PEG1000增加，上相对水的亲和力随之增大，双水相系统上相体积也随之增加，从而提高了上相溶液对辛夷总黄酮的亲和能力，也提高了上相溶液中辛夷总黄酮含量，因而分配系数和萃取率均得到提高。当PEG1000大于40%时，双水相体系因体系中的水减少而导致体系的总体黏度逐渐增大，阻碍了分子在双水相系统中的转移，也阻碍了总黄酮在双水相体系中的转移，从而降低了总黄酮在上相中的富集能力，导致分配系数下降，萃取率下降，与文献[18]至文献[19]结果基本一致。因此，选择PEG1000质量分数为40%进行试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.019.F001图1PEG1000质量分数对辛夷总黄酮得率的影响2.1.2硫酸铵质量分数对辛夷总黄酮得率的影响（见图2）由图2可知，当硫酸铵质量分数小于30%，总黄酮得率随着硫酸铵质量分数增高逐渐增大；硫酸铵质量分数为30%时，总黄酮得率最高，为2.01%；硫酸铵质量分数大于30%时，总黄酮得率随着硫酸铵增高逐渐降低。原因可能是硫酸铵用量增加时会争夺双水相体系中水分子，使总黄酮在PEG1000相中的含量较少，不利于总黄酮的萃取，与文献[12]研究结果基本一致。因此，选择硫酸铵质量分数为30%进行试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.019.F002图2硫酸铵质量分数对辛夷总黄酮得率的影响2.1.3液料比对辛夷总黄酮得率的影响（见图3）由图3可知，当液料比小于40 mL/g时，总黄酮得率随着液料比的增大逐渐增大；当液料比为40 mL/g时，总黄酮得率最高，为2.75%；液料比大于40 mL/g时，总黄酮得率随着液料比增大而逐渐减小。原因可能是当液料比过度增加时，溶剂的量也在不断增多，在萃取辛夷总黄酮时也萃取了部分杂质，阻碍了部分黄酮类物质的浸出，与文献[20]基本一致。因此，选择液料比40 mL/g进行试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.019.F003图3液料比对辛夷总黄酮得率的影响2.1.4提取时间对辛夷总黄酮得率的影响（见图4）由图4可知，提取时间小于30 min时，总黄酮得率随着时间的增加逐渐增大；提取时间为30 min时，总黄酮得率最高，为2.51%；提取时间大于30 min，总黄酮得率反而减少。原因可能是随着提取时间增加，总黄酮类化合物不断溶出，当达到30 min时，总黄酮已经基本溶出，但随着时间进一步增加，对热不稳定的一些黄酮类化合物结构会被破坏，导致黄酮含量下降，与文献[21]至文献[22]结果基本一致。因此，选择提取时间30 min进行试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.019.F004图4提取时间对辛夷总黄酮得率的影响2.2响应面试验及方差分析结果（见表2、表3、图5）由表2可知，通过Design Expert 8.0软件对试验相关数据进行分析，得到回归模型方程，黄酮得率R1=6.63-0.33A-0.48B+0.4C-0.077D+0.21AB-0.042AC-0.22AD-0.27BC-0.19BD+0.12CD-1.24A2-1.04B2-1.01C2-1.13D2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.019.T002表2响应面试验结果试验号A/%B/%C/(g/mL)D/min黄酮得率/%1100-14.26210-103.51300-1-14.574-10014.75500006.706-1-1005.47710013.72801013.50901-104.101000006.58111-1004.341200006.561311003.72140-1105.6415-10105.271610104.53170-10-14.9718001-14.701900114.7320-10-104.082100006.492200-114.1123-100-14.42240-1015.20250-1-104.1526100-14.262710-103.512800-1-14.5729-10014.75由表3可知，回归模型P0.0001，表明回归模型极显著；失拟项P0.05，差异不显著，表明模型成立；模型的相关系数R2=0.975 6与校正相关系数R2Adj＝0.951 2，两者比较接近且均在90%以上，表明此模型具有较高的准确性和通用性。变异系数（CV）=4.59%10.00%，该试验具有很好的稳定性。因此，辛夷总黄酮的最优提取工艺条件可选择此模型进行预测。根据F值判断各因素对总黄酮得率的影响的排序为硫酸铵（B）液料比（C）PEG1000（A）提取时间（D）。一次项D以及交互项AB、AC、AD、BD、CD均差异不显著（P0.05），一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2、D2差异极显著（P0.01），交互项BC差异显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.019.T003表3回归模型的方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型27.310141.95040.000.000 1A1.30011.30026.580.000 1B2.81012.81057.680.000 1C1.95011.95040.080.000 1D0.07010.0701.460.247 7AB0.17010.1703.450.084 3AC7.060×10-317.060×10-30.140.709 4AD0.19010.1903.990.065 6BC0.28010.2805.800.030 4BD0.14010.1402.860.112 7CD0.06010.0601.240.283 8A29.91019.910203.120.000 1B26.95016.950142.590.000 1C26.58016.580134.970.000 1D28.22018.220168.620.000 1残差0.680140.049失拟项0.610100.0613.210.136 3误差0.07640.019总和28.00028注：P0.01表示影响极显著；P0.05表示影响显著。由图5可知，各因素对响应值总黄酮得率的影响与响应面坡度具有关系，坡度越陡峭，影响越大，坡度越平滑，影响越小。硫酸铵和液料比因坡度较陡而交互影响作用显著，硫酸铵和PEG1000质量分数、PEG1000质量分数和时间、硫酸铵质量分数和提取时间、液料比和PEG1000质量分数、液料比和提取时间因坡度较平缓而交互影响作用均不显著，与回归模型的方差分析所得结果一致。图5各因素交互作用对辛夷总黄酮得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.019.F5a1（a）PEG1000质量分数与提取时间对黄酮得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.019.F5a2（b）硫酸铵质量分数与提取时间对辛夷总黄酮得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.019.F5a3（c）PEG1000质量分数与液料比对辛夷总黄酮得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.019.F5a4（d）PEG1000质量分数与硫酸铵对辛夷总黄酮得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.019.F5a5（e）硫酸铵质量分数与液料比对辛夷总黄酮得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.019.F5a6（f）液料比与提取时间对黄酮得率的影响2.3最佳提取条件的确定及验证试验结果通过Design Expert 8.0.6软件对辛夷中总黄酮的最佳提取工艺的条件进行分析预测，发现PEG1000质量分数为39.19%、硫酸铵质量分数为29.43%、液料比为41.21 mL/g、提取时间为30.19 min。依据提取仪器参数设定及经济成本的实际情况，将其最佳提取条件调整为PEG1000质量分数为40%、硫酸铵质量分数30%、液料比40 mL/g、提取时间30 min，对建立的数学模型进行试验验证，验证结果为预测值为6.78%，实际值为6.81%，预测误差为0.79%。2.4辛夷总黄酮对DPPH自由基清除作用（见图6）由图6可知，辛夷总黄酮质量浓度低于1.0 g/L时，对DPPH自由基的清除率随着辛夷总黄酮质量浓度不断增大逐渐上升；浓度达到1 g/L时，DPPH自由基除率为77.36%，再继续增加辛夷总黄酮质量浓度时，清除率基本趋于均衡，辛夷黄酮对DPPH自由基清除率略低于VC。研究表明，辛夷总黄酮具有一定的抗氧化活性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.019.F006图6辛夷总黄酮和VC对DPPH自由基清除作用3讨论本研究采用Box-Behnken方法优化辛夷总黄酮双水相提取工艺，并初步对辛夷总黄酮体外抗氧化性研究，将本方法与3种传统的提取方法（索氏提取法[14]、回流提取法[15]、超声波提取[16-17]）进行比较，索氏提取法[14]、回流提取法[15]、超声波提取[16-17]的黄酮得率分别为3.99%、5.73%和0.98%，均远低于本试验方法（6.78%）。回流提取操作简单但溶剂消耗量大；索氏提取法虽然能耗低，但提取耗时，通常需要3~4 h，而且长时间提取易因受热而导致样品结构破坏。超声辅助提取具有溶剂用量少、无须高温提取等优点，但得率低于回流提取及索氏提取方法。因此本试验采用超声辅助双水相萃取辛夷总黄酮。但超声辅助提取具有超声温度难以控制的缺点，从而导致本试验中单因素试验条件和响应面最佳优化条件下的黄酮得率相差较大。在未来试验中需要进一步验证超声温度对黄酮得率的影响，探究不同有机试剂与无机盐双水相系统对辛夷总黄酮的萃取能力的影响。本试验结果可为后续研究其他双水相系统对辛夷总黄酮的提取提供一定参考。本试验表明，辛夷总黄酮具有较强的体外抗氧化活性，可开发成天然的抗氧剂。4结论本试验表明，试验所用方法提取辛夷总黄酮最佳提取条件为聚乙二醇PEG1000质量浓度40%、硫酸铵质量浓度30%、液料比40 mL/g、提取时间30 min；此条件下对建立的数学模型进行试验验证，预测值为6.78%，实际值为6.81%，预测误差为0.79%。辛夷总黄酮对DPPH自由基清除率达77.36%，表明辛夷总黄酮具有良好的抗氧化活性。