农业农村部要求2020年7月1日起全面禁止在饲料中添加抗生素，植物提取物在养殖投入品中越来越成为热门产品[1-2]。农业农村部第217号公告批准源自金银花中的绿原酸作为具有促生长、抗氧化、改善肠道菌群等功效的新饲料添加剂。异绿原酸在结构上比绿原酸多一个咖啡酰基团，同样具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗炎症等生物活性[3-5]。然而，目前还未有单独将异绿原酸应用于畜禽生产中的报道[6]。甜叶菊已在我国大面积种植30余年[7]，仅2018年我国甜叶菊总栽培面积高达1.81万公顷[8]。提取甜菊糖苷后的甜叶菊剩余部分往往被作为废弃物处理，造成严重的环境污染，并且是对其中大量具有抗氧化抑菌活性异绿原酸类物质的资源浪费[9-11]。因此，若将甜叶菊废弃物中的总异绿原酸提取出来作为饲料添加剂进行开发，既可解决环境污染和资源浪费等问题，也能缓解异绿原酸作为饲添成本过高的问题。本文探究甜叶菊总异绿原酸的抗氧化、抑菌活性及饲料防霉效力，以期为甜叶菊总异绿原酸作为饲料添加剂进行开发提供参考。1材料与方法1.1试验材料甜叶菊总异绿原酸（总酸含量65.8%，生产批号Y2-0921-18101001，以下简称TYJ）由河北晨光生物科技集团股份有限公司提供。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，梯希爱上海化成工业发展有限公司）；FRAP、ABTS总抗氧化能力检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）；没食子酸丙酯（PG，国药集团化学试剂有限公司）；抗坏血酸（VC，阿拉丁公司）；二甲基亚砜（DMSO，北京百灵威科技有限公司）；盐酸金霉素（含量94.1%，生产批号130306-201419，中国食品药品检定研究院）；胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠（国药集团化学试剂有限公司）；大肠杆菌（生产批号AB94011)、金黄色葡萄球菌(生产批号AB2010021）、肠炎沙门氏菌(生产批号AB94010)、枯草芽孢杆菌(生产批号AB90008)均购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；鲜榨菜籽油（长沙县黄兴镇心悦油坊榨油厂）；丁基羟基茴香醚（BHA，国药集团化学试剂有限公司）；食用油酸价速测盒、食用油过氧化值速测盒（广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司）；无添加剂配合饲料（武汉万林生物科技有限公司）；孟加拉红培养基（北京陆桥技术有限公司）。全波段酶标仪（帝肯Infinite M200 PRO型）；紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平UV2400型）；全自动菌落计数仪（迅数icount30F型）等。1.2DPPH自由基清除能力测定参照文献[12]的方法。准确配制1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL的TYJ乙醇溶液及2.0×10-4 mol/L的DPPH乙醇溶液。吸取DPPH乙醇溶液3 mL，加入无水乙醇3 mL，标记为A0；分别取不同浓度的TYJ乙醇溶液3 mL，加入DPPH溶液3 mL，标记为A1；分别取不同浓度的TYJ乙醇溶液3 mL，加入无水乙醇3 mL，标记为A2。所有溶液避光反应30 min，于517 nm波长处测定其吸光度值，每个样品测3组平行并取其平均值，依旧用A0、A1、A2表示，用VC水溶液和PG乙醇溶液代替TYJ进行同样测试。DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%(1)1.3FRAP总抗氧化能力测定准确配制2/5、1/5、1/7、4/35、3/35、2/35、1/35、1/70 mg/mL的TYJ乙醇溶液。具体操作参照FRAP总抗氧化能力检测试剂盒说明书及文献[12]的方法进行。由吸光度（Y）和硫酸亚铁溶液浓度（X）作图得到回归方程为Y=0.322 7X+0.061 8，相关系数R2=0.999 0。如某0.15 g/L样品测定获得的吸光度和0.6 mmol/L FeSO4标准溶液相同，则该样品的总抗氧化能力为0.6 mmol/L/0.15 g/L，即4 mmol/g。1.4ABTS总抗氧化能力测定准确配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L的TYJ乙醇溶液。具体操作参照ABTS总抗氧化能力检测试剂盒说明书及文献[13-14]的方法进行。如某0.5 g/L样品测定获得的抑制率和1 mmol/L Trolox相同，则该样品的总抗氧化能力为1 mmol/L/0.5 g/L，即为2 mmol/g。1.5抑菌活性评价试验按照菌种说明书将4种细菌（黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌）进行复苏与纯化，再分别用接种环挑取纯化后的单菌落于LB液体培养基中振荡培养16~18 h，之后将此4种菌悬液用血球计数板计数，并用LB液体培养基调至1~2×105 CFU/mL。采用文献[15-16]的方法。用25% DMSO水溶液将TYJ配制成2560 mg/L的无菌待测液，再用LB液体培养基将其稀释至2 560、2 304、2 048、1 792、1 536、1 280、1 024、768、512、256、128、 64、32、16、8、4、2、1 mg/L，稀释好的待测液各取100 μL依次加入96孔细菌培养板1~18号孔内，然后每孔均加入100 μL一种细菌菌悬液，这样得到的待测液浓度依次减半，第19孔加100 μL空白培养基和100 μL测试菌悬液，第20孔加200 μL空白培养基，每个浓度均设3个重复。整个96孔板混匀盖好，放37 ℃恒温培养箱培养24 h后观察，孔内无弥散状浑浊或孔底无沉淀的最低药物浓度即为该测试菌株对TYJ的MIC。取无菌生长孔的液体培养物100 μL涂布于LB琼脂平板上，37 ℃继续培养24 h，以无菌落生长的最低药物浓度为MBC。其他3种细菌测试菌悬液也如上操作。同时设立盐酸金霉素作为阳性对照药物代替TYJ按照上述步骤进行同步测定。1.6延缓油脂氧化的评价试验将TYJ以0.1‰、0.2‰、0.3‰、0.4‰、0.5‰的添加量添加到50.0 g鲜榨菜籽油中作为试验组；将BHA以0.2‰的添加量添加到50.0 g鲜榨菜籽油中作为阳性对照组；50.0 g无添加剂鲜榨菜籽油作为空白对照组，每组各设3个重复小组。采用Schaal烘箱耐热试验法[17]，各组均放入（60±1）℃的恒温培养箱中进行加速氧化，选取30 d为1个周期，每3 d测定一次菜籽油的酸价和过氧化值。油脂的酸价和过氧化值检测均采用国标方法[18-19]结合快速检测试剂盒说明书进行，每一个样品检测3次取其平均值。1.7干预饲料中霉菌总数的评价试验将TYJ以0.5‰的添加量添加到无添加剂配合饲料（水分自然11%～12.5%）作为试验组；将双乙酸钠以0.5‰的添加量添加到无添加剂配合饲料作为阳性对照组；以未加防霉剂的饲料作为空白对照组，每组各设3个重复，并在相同自然环境下储放，每隔15 d按照GB/T 14699.1—2005《饲料 采样》[20]进行采样，共采样2次。饲料中霉菌总数采用国标方法GB13092—2006《饲料中霉菌总数的测定》[21]进行。1.8数据统计与分析试验数据采用Excel 2010和GraphPad Prism 8.0.2软件进行One-way ANOVO和Tukey' mutiple分析，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1DPPH自由基清除能力测定（见表1）由表1可知，在溶液浓度为0.1~1 g/L时，TYJ的DPPH自由基的清除能力与VC无差异，其清除率均在95.2%左右，而TYJ的DPPH自由基的清除能力比PG极显著增强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.024.T001表1TYJ及对照药的DPPH自由基清除率项目0.1 g/L0.2 g/L0.4 g/L0.6 g/L0.8 g/L1.0 g/LTYJ95.00a95.11a95.08a95.29a95.47a95.65aVC95.11a95.26a95.26a95.22a95.47a95.33aPG86.09b86.38b87.35b87.74b88.68b88.57b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P0.05)。%2.2FRAP、ABTS总抗氧化能力测定（见表2）由表2可知，由FRAP法得出，Trolox和TYJ的总抗氧化能力分别为7.25 mmol/g和7.39 mmol/g；由ABTS法得出，Trolox和TYJ的总抗氧化能力分别为1 mmol/g和1.42 mmol/g。2种方法均得出TYJ总抗氧化能力强于Trolox。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.024.T002表2TYJ及对照药的FRAP、ABTS总抗氧化能力项目FRAP总抗氧化能力ABTS总抗氧化能力TYJ7.391.42Trolox7.251.00mmol/g2.3抑菌活性评价试验（见表3）由表3可知，通过微量稀释法得出TYJ对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度（MIC）值分别是32、640、1 152、1 152 mg/L，但最小杀菌浓度（MBC）值均大于1 280 mg/L，即杀菌效果不明显。用盐酸金霉素做阳性对照，得出盐酸金霉素对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的MIC值均低于0.5 mg/L，MBC分别为4、8、16、32 mg/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.024.T003表3TYJ及盐酸金霉素对四种细菌的MIC及MBC值项目MIC值MBC值金黄色葡萄球菌沙门氏菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌沙门氏菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌TYJ326401 1521 152＞1 280＞1 280＞1 280＞1 280盐酸金霉素≤0.5≤0.5≤0.5≤0.5481632mg/L2.4延缓油脂氧化的评价试验（见表4、表5）由表4、表5可知，通过比较添加不同浓度梯度TYJ油脂的酸价及过氧化值随天数的变化情况，可以看出0.5‰TYJ油脂的酸价和过氧化值整体较低，故TYJ的最佳量为0.5‰。再用0.5‰TYJ与0.2‰BHA做比较，可以得出最佳添加量TYJ的抗氧化效果优于BHA。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.024.T004表4不同添加浓度TYJ及对照药的油脂酸价随天数变化表项目试验时间/d147101316192225280.1‰TYJ2.402.752.653.053.003.103.253.153.303.500.2‰TYJ2.402.902.653.203.153.253.403.453.503.450.3‰TYJ2.252.902.802.952.953.153.303.153.453.650.4‰TYJ2.102.753.002.853.053.153.303.003.353.550.5‰TYJ2.052.902.952.952.902.953.153.003.453.450.2‰BHA2.252.852.802.903.003.153.303.503.453.60空白油脂2.252.502.552.802.953.103.303.653.803.70mg/kg10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.024.T005表5不同添加浓度TYJ及对照药的油脂过氧化值随天数变化表项目试验时间/d147101316192225280.1‰TYJ0.000.060.060.130.130.150.20.220.220.270.2‰TYJ0.000.000.060.060.130.150.150.180.200.270.3‰TYJ0.000.000.040.040.110.130.130.200.200.250.4‰TYJ0.000.000.000.040.060.060.060.180.200.250.5‰TYJ0.000.000.000.020.060.060.060.180.200.250.2‰BHA0.000.060.060.130.130.180.180.200.200.27空白油脂0.000.000.060.130.150.20.20.250.250.30g/100 g2.5干预饲料中霉菌的评价试验（见表6）由表6可知，霉菌总数试验由于只选择了第15 d和第30 d的饲料进行检测，饲料中的霉菌总数较少；添加了TYJ的饲料霉菌总数比空白组有降低趋势，TYJ组与双乙酸钠组无显著性差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.03.024.T006表6TYJ组、双乙酸钠组及空白组饲料第15、30 d的霉菌总数项目试验时间/d1530TYJ组0.68±0.17ab1.97±0.50ed双乙酸钠组0.31±0.02ac0.35±0.06ef空白组1.03±0.27b2.64±0.78d103 CFU/g3讨论本试验所采用的DPPH法与赵玉静等[12]的研究一致，且结果相似，即阳性对照维生素C的DPPH清除率为90%以上，且随浓度继续增加清除率无明显增加；由于TYJ为组分提取物，在FRAP与ABTS试验中均无法将质量浓度换算成摩尔浓度，故所有试验药物浓度单位均采用g/L。此外，于慧等[9]用甜叶菊废弃物制得生物制剂，其DPPH自由基清除能力可达92.21%，为BHT的1.1倍，VE的5.5倍，与本试验结果相似。Xia等[22]、Liu等[23]和赵磊等[24]通过与本试验相同的方法，分别得出异绿原酸类化合物是艾蒿、金银花醇提物、甜叶菊废渣提取物中抗氧化活性贡献最大的成分，也证实异绿原酸类化合物具有较强的抗氧化活性。Iwai等[25]通过DPPH等试验证明异绿原酸类化合物的抗氧化活性是绿原酸的2倍，可进一步得出异绿原酸在抗氧化方面可以替代绿原酸。本试验所采用的微量稀释法与何涛[15]的研究一致，且均采用DMSO作为助溶剂。相比于赵磊等[10]从甜叶菊废渣中提取得到的产品对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为3.13 g/L和12.5 g/L，对大肠杆菌和沙门氏菌无抑菌作用，本研究对此4种细菌的抑制作用明显增强，或许由于本研究所使用的产品主要成分为异绿原酸。目前，针对异绿原酸抑细菌的研究较少，绿原酸抑细菌的较多[3,26-28]。而异绿原酸拥有两个咖啡酰基团，比绿原酸羟基更多，结构更对称，因此理论上比后者更能破坏细菌的细胞壁及细胞膜，从而达到更好抑菌的效果，与周志娥等[29]发现的异绿原酸A对大肠杆菌的抑制作用强于绿原酸、苯甲酸钠和山梨酸钾的结论相一致。全国饲料工作办公室《新饲料、新饲料添加剂申报指南》规定，可用油脂代替饲料进行饲料抗氧化剂效力的评定试验。根据国标GB2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[30]规定，BHA在油脂中的最大使用量为0.2‰，而一般植物提取物在油脂中的添加量为0.5‰左右（茶多酚0.4‰，茶多酚棕榈酸酯0.6‰，迷迭香提取物0.7‰），故本试验设计叶菊总异绿原酸在油脂中的添加浓度梯度为0.5‰以内的5个点。本试验发现，在第12 d前TYJ组酸价高于BHA组，而第12 d后低于后者，这可能是由于TYJ本身带酸性，第12 d前酸价检测过高，而12 d后由于TYJ对油脂的抗氧化保护效果优于BHA，第12 d后酸价变化并未加快，酸价检测低于BHA，此现象可说明TYJ长期添加于油脂中时其抗氧化保护效果优于BHA。于慧等[9]的试验也报道了甜叶菊废渣提取物对鲐鱼松的抗氧化保护作用比BHT、天然鱼露抗氧化效果更好。前期调研发现，绿原酸类化合物在饲料中的有效剂量为0.2~0.8 g/kg[31-32]。因此，本试验中TYJ以0.5 g/kg的添加量添加到无添加剂配合饲料中作为试验组；双乙酸钠作为一种多功能的防霉剂，其防霉效果比丙酸钙、山梨酸钾和柠檬酸强[33]，故将双乙酸钠以0.5 g/kg的添加量作为阳性对照组。根据国标GB 13078—2017《饲料卫生标准》[34]规定，合格的饲料中霉菌总数不得超过4×104 CFU/g。本试验中的任意组饲料在存放了30 d之后均未出现变质，与黄通旺[35]在普通饲料中添加1 g/kg的双乙酸钠可在40 d以上有效抑制饲料中霉菌的生长的研究结果相一致。4结论甜叶菊总异绿原酸抗氧化活性与维生素C相当，优于没食子酸丙酯与Trolox；其对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均具有较好的抑菌活性；最佳添加量（0.5‰）的甜叶菊总异绿原酸对油脂的抗氧化效果优于国标规定添加量（0.2‰）的丁基羟基茴香醚；甜叶菊总异绿原酸能降低饲料中的霉菌总数，虽效果不及双乙酸钠，但由于其来源于天然植物，具有廉价、天然、健康等优势，可将其作为饲用抗氧化剂或防霉剂进行开发。