十溴二苯乙烷（decabromodiphenyl ethane，DBDPE）作为十溴二苯醚的替代产品，是一种新型溴系阻燃剂，具有燃烧时不会产生致癌物质且阻燃效果与十溴二苯醚相仿的优点[1]，但也具有与十溴二苯醚相似的生物累积潜力与毒性[2]。许多报道显示，DBDPE在空气、水体、污泥、土壤以及生物群体中普遍存在，并可逐级生物富集[3]，动物长期暴露于DBDPE的概率大大提升。DBDPE毒性的相关研究尚处于起步阶段，已有报道显示，DBDPE可对小鼠产生生殖发育毒性、肝肾毒性、神经行为毒性以及心血管毒性[4-5]，但毒性的作用机制尚不清楚。Feng等[6]发现，长期接触溴系阻燃剂会影响鱼类的抗氧化系统，并引发氧化应激。但DBDPE对哺乳动物氧化应激水平的影响作用尚存在争论。因此，本研究选择小鼠作为研究对象，探讨不同剂量DBDPE长期暴露对小鼠体内氧化应激相关指标的影响，以期为研究DBDPE的毒性作用机制提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物60只SPF级雌性KM小鼠，体重33~37 g，7周龄，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，试验动物使用许可证号为：SCXK（湘）2019-0014。购入后常规饲养7 d以适应环境，室温22~25 ℃，自由进食进水。1.1.2试验试剂DBDPE（上海麦克林科技生化有限公司）、十溴联苯醚（BDE-209，上海麦克林科技生化有限公司）、氯化钠（分析纯，成都金山化学试剂有限公司）、玉米油（山东三星玉米产业科技有限公司）。乳酸脱氢酶（LDH）、微量还原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽-S转移酶（GSH-ST）、总蛋白（TP）生化指标测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。1.1.3试验仪器CD-UPT-1型纯水仪（成都纯越科技有限公司）、PerkinElmer EnSpire多模式微孔板检测仪/酶标仪（美国PERKINELMER公司）、UV-1800紫外可见分光光度计（岛津仪器（苏州）有限公司）、DHP-9052电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、3K-15型台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司）、KZ-Ⅱ高速组织研磨仪（武汉塞维尔生物科技有限公司）、TW20恒温水浴槽（优莱博技术（北京）有限公司）。1.2试验方法1.2.1试验设计60只雌性KM小鼠随机分为5组，分别为空白对照组（D0组）、5 mg/kg DBDPE组（D5组）、50 mg/kg DBDPE组（D50组）、500 mg/kg DBDPE组（D500组）及50 mg/kg BDE-209+50 mg/kg DBDPE组（B50+D50组），每组12只，每组3个重复，每个重复4只小鼠。将DBDPE及BDE-209粉末溶于玉米油中，各染毒组小鼠分别暴露于5、50、500 mg/（kg·d） bw的DBDPE及50 mg/（kg·d） bw DBDPE联合50 mg/（kg·d） bw BDE-209，空白对照组给予等剂量的玉米油，连续灌胃28 d，建立小鼠DBDPE暴露模型。1.2.2样品采集试验最后1 d染毒12 h后，所有小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉后眼球采血，剖开腹腔，采集肝脏和肾脏组织。血液样品4 ℃静置过夜，3 000 r/min离心10 min，收集上层血清保存于-80 ℃用于后续试验。肝脏、肾脏样品按照试剂盒说明书的要求，准确称取其重量，按重量（g）∶体积（mL）=1∶9比例加入9倍的生理盐水制成肝脏、肾脏组织匀浆液，3 000 r/min离心10 min，取上清液即10%肝组织匀浆上清液和10%肾组织匀浆上清液，将组织匀浆上清液保存于-80 ℃用于后续试验。1.2.3测定指标及方法1.2.3.1血清中氧化应激相关指标测定按照MDA和LDH检测试剂盒说明书要求配制相关试剂，检测血清中MDA含量及LDH活性。1.2.3.2肝、肾组织中氧化应激相关指标测定取出10%肝组织匀浆及10%肾组织匀浆上清液，按照总蛋白（TP）定量试剂盒说明书要求检测10%小鼠肝、肾匀浆蛋白浓度；按照MDA、GSH、SOD、CAT、GSH-ST生化指标检测试剂盒说明书要求配制相关试剂，根据说明书步骤，分别使用酶标仪和紫外分光光度计检测小鼠肝、肾组织中MDA和GSH含量以及SOD、CAT和GSH-ST活性。1.3数据统计与分析试验数据采用SPSS Statistics 25.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），Graphpad Prism 9软件进行绘图。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1DBDPE对小鼠血清中MDA含量及LDH活性的影响（见图1）由图1可知，随着DBDPE剂量增加，小鼠血清中MDA含量逐渐下降。与D0组相比，D500组和B50+D50组小鼠血清中MDA含量均极显著下降（P0.01）。与D0组相比，D50组小鼠血清中LDH活性显著下降（P0.05）；D500组和B50+D50组小鼠血清中LDH活性升高，但差异不显著（P0.05）。D500组和B50+D50组小鼠血清中LDH活性极显著高于D50组（P0.01）。图1DBDPE对小鼠血清中MDA含量和LDH活性的影响Fig.1Effect of DBDPE on MDA content and LDH activity in serum of mice注：不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.001.F1a1XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.001.F1a22.2DBDPE对小鼠肝脏中氧化应激相关指标的影响（见表1）由表1可知，与D0组相比，D50组小鼠肝脏组织中MDA含量极显著升高（P0.01），D5组与D500组肝脏MDA含量显著下降（P0.05）；D5组、D500组与B50+D50组小鼠肝脏中CAT活性均显著降低（P0.05）。各DBDPE染毒组肝脏中SOD活性与GSH含量随染毒剂量升高而逐渐升高，与D0组相比，D50组、D500组与B50+D50组小鼠肝脏中SOD活性均极显著升高（P0.01），D500组与B50+D50组小鼠肝脏中GSH含量均极显著升高（P0.01）；D500组小鼠肝脏中GSH-ST活性极显著升高（P0.01）。D500组小鼠肝脏中GSH含量极显著高于D5组和D50组（P0.01），GSH-ST活性显著高于D5组和D50组（P0.05），SOD活性显著高于D50组（P0.05），并极显著高于D5组（P0.01）。B50+D50组小鼠肝脏CAT活性和MDA含量低于D50组（P0.05），而GSH含量及SOD、GSH-ST活性高于D50组（P0.05）。B50+D50组小鼠肝脏中氧化应激相关指标变化趋势与D500组相似。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.001.T001表1DBDPE对小鼠肝脏中氧化应激指标的影响Tab.1Effects of DBDPE on oxidative stress related indicators in mice liver组别TP/(g/L)MDA/(μmol/g)CAT/(U/g)SOD/(U/mg)GSH/(μmol/g)GSH-ST/(U/mg)D0组0.27±0.021.17±0.10Ab51.54±2.50b95.46±10.13Aa4.56±0.70A18.20±1.60ABaD5组0.24±0.070.77±0.13Aa38.68±8.50a104.64±9.71ABab4.61±1.00A10.22±0.64AaD50组0.29±0.091.85±0.04Bc49.10±8.35ab115.88±6.05BCbc4.85±0.43A19.02±2.89ABaD500组0.22±0.020.81±0.20Aa38.63±4.33a132.48±5.82Cd7.31±0.89B43.95±5.21BbB50+D50组0.28±0.040.85±0.10Aab40.01±1.77a127.66±9.19Ccd7.30±0.24B23.43±0.47ABa注 ：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.3DBDPE对小鼠肾脏中氧化应激相关指标的影响（见表2）由表2可知，与D0组相比，D500组小鼠肾脏组织中MDA含量极显著升高（P0.01）；各染毒组小鼠肾脏组织中CAT活性均极显著下降（P0.01）。各DBDPE染毒组肾脏组织中SOD活性随染毒剂量升高而逐渐升高，与D0组相比，D50组和D500组小鼠肾脏中SOD活性均极显著升高（P0.01）；B50+D50组小鼠肾脏中GSH含量极显著升高（P0.01）；D5组和D500组小鼠肾脏中GSH-ST活性显著升高（P0.05）。D500组小鼠肾脏中MDA含量和SOD活性高于D5组和D50组；B50+D50组小鼠肾脏MDA含量及SOD活性与D50组相比差异均不显著（P0.05），CAT和GSH-ST活性均显著低于D50组（P0.05），而GSH含量极显著高于D50组（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.001.T002表2DBDPE对小鼠肾脏中氧化应激指标的影响Tab.2Effects of DBDPE on oxidative stress indicators in mice kidney组别MDA/(μmol/g)CAT/(U/g)SOD/(U/mg)GSH/(μmol/g)GSH-ST/(U/mg)D0组3.08±0.25A109.54±7.91Bc335.20±49.06Aa1.03±0.09A46.94±6.20ABabD5组3.56±0.50A64.90±12.00Aab363.56±63.72ABab0.95±0.23A55.99±4.70BcD50组2.91±1.38A75.48±16.51Ab436.54±31.00ABbc1.13±0.06A51.70±5.25ABbcD500组4.41±1.40B69.21±7.37Aab444.67±15.39Bc1.04±0.14A54.65±4.22BcB50+D50组2.72±1.66A54.39±8.71Aa388.01±15.51ABabc1.48±0.09B42.78±2.05Aa3讨论中国是溴系阻燃剂生产和使用大国，2006—2016年DBDPE生产总量约23万t。DBDPE具有持久性、生物积累性、毒性以及长距离迁移能力，对我国环境和人类健康的潜在威胁已引起人们的高度重视[7]。研究表明，DBDPE对大鼠具有肝毒性效应，可通过诱导SD大鼠肝脏氧化应激和炎症反应干扰大鼠的正常代谢，抑制孕烷X受体（PXR）和雄甾烷受体（CAR），进而抑制细胞色素P450 3A（CYP3A）酶的表达，产生肝毒性作用，对大鼠肝脏造成损伤[8]。本研究探讨了不同剂量的DBDPE对昆明小鼠氧化应激的影响，结果表明，DBDPE暴露可主要通过下调CAT活性和上调SOD活性，破坏小鼠体内氧化还原稳态，诱导小鼠肝脏和肾脏氧化应激损伤，导致肝肾毒性作用，其中500 mg/kg DBDPE对机体氧化还原系统影响较大。CAT和SOD是机体重要的抗氧化物酶，GSH是机体重要的抗氧化物质，MDA是氧化应激过程中脂质过氧化的终产物，因此SOD、CAT、GSH和MDA常作为判断机体氧化应激反应的指标[9]。本研究中，不同剂量的DBDPE暴露后，小鼠肝脏和肾脏中CAT活性均呈不同程度的下降，而SOD活性和GSH含量呈不同程度上升，且表现出SOD活性随DBDPE剂量增加而上升的趋势。研究表明，菌体主要通过氧化、羟基化及脱溴途径对DBDPE进行降解，DBDPE进入平菇菌体后，首先诱导活性氧（ROS）生成，进而通过诱导SOD及CAT清除菌体内多余的ROS，两种抗氧化酶起到协同作用，共同清除DBDPE产生的毒性效应[10]。本研究中，SOD增强可能是机体通过调动抗氧化酶活性抗DBDPE诱导的损伤。SOD可催化O2-转化成H2O2及O2，清除氧自由基，维持氧自由基产生与消除的动态平衡[11]。CAT可催化积累的H2O2分解成H2O和O2，广泛存在于肝脏与肾脏。肝脏与肾脏是清除过氧化氢的主要场所，环境污染物可与CAT的活性基团相互作用，改变酶活性，从而产生毒性作用[12]。本研究中CAT酶活性下降，说明持续的DBDPE毒性超过了小鼠自身抗氧化防御能力，导致细胞内H2O2不能被及时清除，机体氧化还原稳态破坏，机体产生抗损伤反应，SOD活性、GSH含量等升高以调节机体氧化还原平衡。Wang等[13]研究表明，SOD活性还与DBDPE清除能力正相关，DBDPE暴露后诱导机体SOD活性升高，利于促进DBDPE的降解。Jing等[14]发现，人正常肝细胞（L-02细胞）暴露于DBDPE后，SOD活性及GSH含量降低，ROS、MDA含量及LDH活性增加，SOD与GSH的变化趋势与本研究一致。研究表明，SOD与GSH变化趋势与DBDPE暴露剂量、动物性别有关。Sun等[15]研究表明，中、高剂量DBDPE暴露后，大鼠肝脏中MDA水平显著提高，50 mg/kg DBDPE暴露导致GSH含量增加，500 mg/kg DBDPE暴露导致SOD活性降低。王小娇等[16]发现，长期暴露于DBDPE的斑马鱼内脏会产生氧化损伤并且影响其生理功能，且雄鱼与雌鱼在抗氧化酶活性变化上也存在显著差异，雄鱼内脏中SOD、CAT活性显著高于雌性。饵料中长期添加DBDPE可诱导草鱼幼鱼肝脏中氧化应激酶[SOD、CAT和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）]活性及抗氧化物质（GSH）含量显著升高，且呈现低浓度诱导高浓度抑制的效应[17]。分析本研究中采用的DBDPE剂量对SOD、GSH为诱导作用，小鼠抗氧化防御能力随DBDPE的暴露增加而逐渐提升，500 mg/kg DBDPE暴露对小鼠氧化应激指标的影响最大。体内氧化水平与抗氧化水平失衡，超过机体的代偿能力时，过度氧化应激将对组织细胞造成损伤，引起组织细胞的病理变化[18-19]。MDA可间接反映细胞氧化应激损伤的程度[20]。本研究结果表明，50 mg/kg DBDPE暴露28 d可导致小鼠肝脏中MDA含量极显著升高，而500 mg/kg DBDPE暴露未引起MDA含量显著变化，分析其与500 mg/kg DBDPE诱导GSH含量显著升高有关。GSH是一种脂质过氧化抑制剂与氧自由基清除剂，可抑制脂质过氧化，减少MDA含量。500 mg/kg DBDPE暴露导致小鼠肾脏中MDA含量极显著升高，与肾脏相比，低剂量的DBDPE即可诱导肝损伤。这可能与DBDPE对不同组织的亲和力不同有关[21]，而肝脏又是机体重要的解毒器官，更易受损伤。本研究中，低剂量的DBDPE未导致MDA含量升高，甚至导致血清中MDA含量下降，可能是由于一些过氧化酶活性升高及时去除了自由基等氧化物质，减轻氧化应激损伤，减少MDA产生，与SOD活性升高相符。GSH-ST是一种具有清除体内过氧化物及参与肝脏解毒双重功能的酶，通过与GSH结合在氧化应激代谢产物的解毒中起到重要作用[22]。500 mg/kg DBDPE暴露诱导小鼠肝脏与肾脏中GSH-ST活性显著升高，间接表明肝脏和肾脏中过氧化物水平升高，机体抗氧化能力升高，肝脏解毒能力增强，这与肝脏中MDA含量未升高的结果相符。而50 mg/kg DBDPE诱导机体LDH活性显著下降，分析其与肝脏发生氧化应激损伤，MDA含量显著升高相关。由于多种环境污染物常存在联合作用[5,15,23-24]，本研究设置50 mg/kg DBDPE与BDE-209联合染毒组，比较联合染毒与单一染毒的毒性效应。有研究显示，金鱼暴露于DBDPE 14 d后可致肝脏出现氧化应激，抗氧化活性和GSH水平被显著抑制，且十溴二苯醚引起的氧化应激反应比其替代品DBDPE更严重[25]。本研究发现，联合染毒导致小鼠肝脏CAT活性和MDA含量低于单独染毒组，而肝脏中GSH含量、SOD和GSH-ST活力高于单独染毒组。联合染毒组小鼠肝脏中氧化应激相关指标变化趋势与500 mg/kg DBDPE暴露对机体氧化还原平衡影响相似，但仍需进一步验证。4结论综上所述，本研究在一定程度上表明了不同剂量DBDPE暴露致小鼠出现不同程度的氧化应激，其中500 mg/kg DBDPE对机体氧化还原系统影响较大。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.001.F002