骨质疏松是一种以骨量减低、骨组织微结构恶化、骨脆性增加、易发生骨折为特征的营养代谢性骨病[1]。随着畜牧业迅速发展，集约化养殖导致畜禽长期处于应激环境，骨质疏松的发病率也呈逐年上升的趋势[2]。有研究表明，环境因素以及年龄增长导致机体内氧化反应加剧，产生过多的活性氧（ROS），破坏了成骨细胞和破骨细胞等相关细胞之间的骨代谢平衡。ROS能够抑制成骨细胞分化，促进破骨细胞分化，损伤骨组织结构，骨量减少，导致骨质疏松发生[3-5]。骨质疏松作为一种慢性营养代谢性疾病，治疗过程相对比较漫长[6-9]。现有治疗骨质疏松的有效药物主要包括有骨代谢调节药物和钙磷补充剂等，具有延缓骨质流失的作用，但在防止骨吸收或促进合成代谢方面的作用有限，长期使用会对机体造成不可逆的损伤[10-12]。熊果酸又名乌索酸，是一类五环三萜类化合物，存在于女贞子、夏枯草、野木瓜、山茱萸、山楂等天然植物中，来源十分广泛[13-14]。研究发现，熊果酸具有较强的抗氧化能力[15-17]，而且毒副作用小，在实际应用中可忽略不计，是比较理想的替代治疗选项[18]。MC3T3-E1细胞系属于成骨细胞前体细胞，是检测成骨细胞体外增殖情况的理想细胞[19-20]。本试验通过不同浓度熊果酸对H2O2诱导氧化应激MC3T3-E1细胞的保护作用并使用抑制剂，研究熊果酸对成骨细胞氧化损伤的保护作用和OPG蛋白表达以及相关通路的影响，以期探讨熊果酸的成骨作用机制。1材料与方法1.1试验材料1.1.1MC3T3-E1细胞MC3T3-E1细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。1.1.2试剂与仪器熊果酸（北京索莱宝科技有限公司），α-MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（美国赛默飞世尔科技公司）。细胞增殖及毒性检测（CCK-8）试剂盒、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），骨保护素（OPG）检测试剂盒、核因子κB受体活化剂配体（RANKL）试剂盒（日本Dojindo），ERK抑制剂（PD98059）、p38MAPK抑制剂（SB203580）和JNK抑制剂（SP600125）（Sigma-Aldrich）。TGL-16B普通离心机（湖南星科科学仪器）、恒温冰箱（SIEMENS）、MDF-382E（N）超低温冰箱（德国赛默飞世尔有限公司）、台式低温高速离心机（Thermo Fisher）、IF50酶标仪（瑞士帝肯公司）、Nikon Eclipse E100 光学显微镜（日本尼康公司）、二氧化碳培养箱（日本三洋公司）、0.22μM滤器（美国密理博公司）、96孔板（美国Costar公司）、细胞培养瓶（美国Costar公司）。1.2试验方法1.2.1熊果酸对H2O2诱导MC3T3-E1细胞损伤的保护作用MC3T3-E1细胞在α-MEM中添加10% FBS和1%青霉素（100 U/mL)-链霉素（100 g/mL）的培养基中进行培养。在培养过程中，每隔 3 d 更换一次培养液。更换培养液时，将原细胞瓶中的培养液吸取丢弃，吸取无菌PBS缓慢冲洗2次，再采集细胞。用胰蛋白酶在细胞瓶内消化1~3 min，用光学显微镜观察。若在摇晃细胞瓶后，贴壁细胞处于活动的状态，即可认为是消化完毕。用新的含有FBS的培养液迅速加入细胞瓶中以阻止其消化，之后吸取细胞瓶中的培养液，1 500 r/min离心5 min。将上清液弃出，再用新的培养液重新悬浮，置于细胞瓶中进行培养。对细胞瓶进行消毒后，置于二氧化碳培养皿中（37 ℃、5% CO2）。细胞处于对数期时，以每孔100 μL接种于96孔培养板中，培养2~3 d，期间将96孔板放至显微镜下观察，待细胞完全贴壁则可以各孔液体吸净弃去，在96孔板加入不同试剂准备试验。空白对照组（C组）每孔加入100 μL α-MEM培养基；模型对照组（H2O2组）每孔加入100 μL含H2O2（0.45 μmol/L）的培养基；熊果酸组分别加入100 μL含不同浓度熊果酸（50.00、20.00、10.00、1.00、0.10、0.01 μmol/L）和H2O2（0.45 μmol/L）的培养基，每组设5个重复。培养24、48 h后收集细胞上清液，上述所有试验步骤均重复两次。采用CCK-8方法测定各组细胞的生长及活力。收集保存96孔板中上清液，按每孔100 μL培养基的浓度添加10 μL的CCK-8试剂，添加完成后振荡96孔板，将每一个孔洞内的液体混匀。将96孔板置于细胞培养箱中，继续孵育2 h，用450 nm的酶标仪检测其吸光度，结果采用吸光度反映细胞的活力。以碱性磷酸酶（ALP）测定其分化程度；采集细胞上清液进行处理和加样，置于酶标仪中，设定520 nm的波长，并测量其吸光度。试验结果用吸光度数值对细胞的ALP活力进行评估。采用ELISA方法测定不同组细胞的上清液中OPG、RANKL蛋白的水平。按试剂盒说明操作完成后将96孔板置于酶标仪中，设定450 nm的波长，并测量其吸光度。1.2.2信号通路抑制剂对熊果酸抗氧化作用的影响将1 mg PD、SP或SB抑制剂粉精确称重，分别在DMSO中溶解，过滤去除细菌，使用前用α-MEM稀释至20 μmol/L。MC3T3-E1细胞培养培养24 h。空白对照组（C组）每孔加入100 μL α-MEM培养基；模型对照组（H2O2组）每孔加入100 μL含H2O2（0.45 μmol/L）的培养基。熊果酸组分为熊果酸药物组及熊果酸抑制剂组，熊果酸药物组加入20 μmol/L熊果酸和H2O2共处理的细胞；抑制剂组加入熊果酸以及SB、SP或PD抑制剂的细胞和H2O2，分别为熊果酸+SB组、熊果酸+SP组和熊果酸+PD组，每组5个重复孔。培养24 h后收集细胞上清液，测定细胞活力、ALP活性、OPG含量，方法同1.2.1。上述所有试验步骤均重复两次。1.3数据统计与分析试验数据采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，LSD法进行组间差异比较，GraphPad Prism 9.4.1软件作图。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1熊果酸对H2O2诱导MC3T3-E1细胞损伤的保护作用2.1.1熊果酸对MC3T3-E1细胞相对活力的影响（见图1）由图1可知，与C组相比，H2O2处理24 h和48 h后，模型对照组细胞的活力显著降低（P0.05）。浓度为10.00~0.01 μmol/L的熊果酸药物组与模型对照组差异不显著（P0.05），显著低于C组（P0.05）。与模型对照组相比，50.00~20.00 μmol/L的熊果酸药物组的细胞活力均显著增加（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.004.F001图1熊果酸对MC3T3-E1细胞相对活力的影响Fig.1Effect of ursolic acid on relative activity of MC3T3-E1 cells注 ： 不同字母表示各组差异显著（P0.05），相同字母差异不显著（P0.05）；下图同。2.1.2熊果酸对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响（见图2）由图2可知，经H2O2处理24 h后，与C组相比，模型对照组ALP活性显著降低（P0.05）；但H2O2处理48 h后，模型对照组与C组相比差异不显著（P0.05）。H2O2处理24 h后，50.00~20.00 μmol/L以及1.00~0.01 μmol/L熊果酸药物组ALP活性显著低于模型对照组和C组（P0.05）；10.00 μmol/L熊果酸药物组与模型对照组相比差异不显著（P0.05）；H2O2处理48 h后，50.00~0.01 μmol/L熊果酸药物组的ALP活性均显著低于模型对照组和C组（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.004.F002图2熊果酸对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响Fig.2Effect of ursolic acid on ALP activity in MC3T3-E1 cells2.1.3熊果酸对MC3T3-E1细胞OPG含量和RANKL蛋白分泌的影响（见图3）由于50.00~20.00 μmol/L结果明显，后续试验直接采用明显的剂量范围。由图3（a）可知，经H2O2处理24 h和48 h后，模型对照组 OPG含量显著低于C组（P0.05）；与模型对照组相比，熊果酸各药物组OPG含量均显著增加（P0.05）；在相同浓度的熊果酸作用下，24 h成骨细胞OPG蛋白分泌高于48 h。由图3（b）可知，经H2O2处理24 h和48 h后，各组RANKL水平差异均不显著（P0.05）。由图3（c）可知，OPG/RANKL的变化趋势与OPG的结果基本一致。图3熊果酸对MC3T3-E1细胞OPG含量和RANKL蛋白分泌的影响Fig.3Effects of ursolic acid on OPG content and RANKL protein secretion in MC3T3-E1 cellsXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.004.F3a1XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.004.F3a2XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.004.F3a32.2信号通路抑制剂对熊果酸抗氧化作用的影响（见图4）由图4（a）可知，与C组相比，模型对照组细胞活力显著降低（P0.05）；与模型对照组相比，熊果酸药物组细胞活性显著增高（P0.05）；与熊果酸药物组相比，熊果酸+SB组、熊果酸+SP组和熊果酸+PD组细胞活性均显著降低（P0.05）。图4信号通路抑制剂对熊果酸抗氧化作用的影响Fig.4Effect of signaling pathway inhibitors on antioxidant activity of ursolic acidXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.004.F4a1XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.004.F4a2XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.004.F4a3由图4（b）可知，与熊果酸药物组相比，熊果酸+SB组、熊果酸+SP组的ALP活性显著降低（P0.05）。由图4（c）可知，与C组相比，模型对照组的OPG含量显著降低（P0.05）。与模型对照组相比，熊果酸药物组的OPG蛋白含量显著增加（P0.05）。与熊果酸药物组相比，熊果酸+SB组、熊果酸+SP组和熊果酸+PD组的OPG蛋白含量均显著降低（P0.05）。3讨论3.1熊果酸对H2O2诱导MC3T3-E1细胞损伤的保护作用本研究以MC3T3-E1细胞作为成骨样细胞模型，发现在H2O2作用下MC3T3-E1细胞的增殖以及OPG蛋白表达均被显著抑制，表明了H2O2诱导的氧化应激反应抑制了成骨细胞的增殖。不同浓度的熊果酸培养24 h和48 h后，高浓度组（50.00~20.00 μmol/L）可以通过提高细胞活力促进MC3T3-E1细胞的增殖。ALP存在于细胞分化的早期，调节骨形成，标志成骨细胞的成熟和分化[21]。然而本试验中，培养24 h和48 h后各试验组ALP活性依旧低于模型对照组，表明在氧化应激条件下，熊果酸对成骨细胞的保护作用是促进成骨细胞增殖，提高细胞活力而不是增加早期分化。骨形成过程中，骨细胞的激活受到多种通路的调控，其中包括RANKL/OPG通路。OPG是骨保护素，RANKL是NF-kB受体激活剂的配体，二者均由骨相关细胞产生并通过影响破骨细胞和成骨细胞的分化增殖调节骨重建过程[22]。在培养24 h和48 h后，不同浓度熊果酸组的OPG蛋白水平相较于模型组均明显提高，但RANKL水平无明显差异，表明熊果酸对MC3T3-E1细胞的增殖作用通过增加OPG含量抑制破骨细胞形成实现。上述结果表明，熊果酸能够促进H2O2诱导氧化损伤的MC3T3-E1细胞增殖和蛋白表达。3.2熊果酸促MC3T3-E1细胞增殖相关通路研究丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，维持参与细胞周期进程和促进细胞增殖的调节的平衡，其中JNK、p38 MAPK和ERK通路是MAPKs的经典亚型[23]。本试验中，在培养24 h后，熊果酸+SB组、熊果酸+SP组和熊果酸+PD组均显著降低了熊果酸对MC3T3-E1细胞的保护作用，表明熊果酸对MC3T3-E1细胞的增殖和OPG表达的促进作用与MAPK的ERK、JNK、p38等3条通路均具有不同程度的相关性，熊果酸可有效激活3条通路抑制氧化应激过程，进而达到促进MC3T3-E1细胞增殖、提高MC3T3-E1细胞活力的作用。本试验结果表明，熊果酸可通过激活ERK、JNK和p38 MAPK等3条通路促进H2O2诱导氧化损伤的MC3T3-E1细胞增值和蛋白表达。4结论随着畜牧业飞速发展以及伴侣动物老龄化程度不断加深，研究更高效、更安全的骨质疏松症防治药物成为热点研究方向。熊果酸抗氧化性极佳，还具有毒性小、安全范围大等突出特点，是作为原发性骨质疏松症畜禽动物用药与饲料添加剂的首选。本研究结果表明，熊果酸对骨质疏松症具有保护作用以及证明了熊果酸对氧化损伤成骨细胞的保护作用与MAPK信号通路相关，为熊果酸在实际应用中的进一步开发提供参考。