松花粉是松科植物马尾松、油松和其他同属植物的花粉，被2015版《中国药典》收录。松花粉味甘、性温，归脾经、肝经，祛风益气、收湿、止血，治头旋眩晕、中虚胃疼、久痢、诸疮湿烂、创伤出血。我国医学古籍中收载仅有2种花粉，松花粉是其中之一，也是唯一的药食兼用花粉。松花粉品质纯净、成分稳定、不含任何动物激素、无农药残留物、口感好，服用时有淡淡松子香味，堪称“花粉之王”[1]。近年来研究表明，松花粉是一种纯天然的药食两用植物花粉，具有延缓衰老、抗疲劳、降血脂、增强人体免疫力、健胃护肝等多种功效[2]。目前关于松花粉的应用研究较少，鲜有肉鸡饲料中添加松花粉的报道[3]。虽然松花粉的生理活性已有大量研究，但其生理活性的作用机制仍不明确，如松花粉延缓衰老、抗疲劳、降血脂、增强人体免疫力、健胃护肝等[4]相关机制仍需进一步探索。本试验研究松花粉对肉鸡生长性能、肠道结构和免疫功能的影响，旨在阐明松花粉提高肉鸡免疫功能、修复肠道损伤和提高生长性能等作用及机制，并为松花粉在饲料添加剂方面的开发和利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物试验使用的1日龄爱拔益加（AA）肉仔鸡由锦州鸿强牧业有限公司提供。1.1.2试验日粮试验基础日粮为大成农技（葫芦岛）有限公司生产的育雏期配合饲料（产品编号：O/DHNJ），原料组成包括：玉米、豆粕、棉籽粕、鱼粉、碳酸氢钙、石粉、氯化钠、氯化胆碱、微量元素、维生素和功能性氨基酸，营养水平见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.006.T001表1基础日粮营养水平Tab.1Basic dietary nutrient level项目粗蛋白/%粗纤维/%粗灰分/%钙/%总磷/%氯化钠/%水分/%赖氨酸/%含量≥20.0≤6.0≤8.00.6~1.2≥0.550.3~0.8≤14.0≥1.01.1.3主要试剂松花粉（纯度≥98%，西安世泽源生物科技有限公司）、盐酸左旋咪唑（四川省飞天动物药业有限公司）。白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）和干扰素-γ（IFN-γ）ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所），鸡外周血淋巴细胞分离液（北京索莱宝科技有限公司）。1.2试验设计选用1日龄肉仔鸡300只，随机分成5组，每组3个重复，每个重复20只鸡。设KB组、YX组、SHF 1 g/kg组、SHF 2 g/kg组和SHF 4 g/kg组。KB组肉仔鸡饲喂基础日粮，YX组在基础日粮中添加0.2 g/kg盐酸左旋咪唑，SHF 1 g/kg组、SHF 2 g/kg组和SHF 4 g/kg组在基础日粮中分别添加1、2和4 g/L松花粉。试验期间所有肉仔鸡自由饮水和采食，7日龄免疫新城疫La sota株油乳剂灭活疫苗，28日龄加强免疫，免疫方式按说明书操作。试验期42 d。1.3测定指标及方法1.3.1鸡新城疫抗体参考宋依等[5]的方法，在21日龄、28日龄、35日龄和42日龄，各组分别随机抽取10只鸡，翅静脉采血1 mL，2 000 r/min离心5 min分离血清，采用血凝和血凝抑制试验检测鸡新城疫抗体滴度。1.3.2外周血淋巴细胞增殖参考张恒瑞等[6]的方法，在28日龄，各组每个重复分别随机抽取1只鸡，翅静脉采血1 mL，采用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，MTT法检测外周血淋巴细胞增殖情况，结果以刺激指数表示。刺激指数=给药组的OD值/KB组的OD值×100%（1）1.3.3外周血细胞因子含量参考李贤等[7]的方法，在28日龄，各组每个重复分别随机抽取1只鸡，翅静脉采血1 mL，2 000 r/min离心5 min分离血清，采用ELISA法检测血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的含量，按照ELISA检测试剂盒说明书操作。1.3.4免疫器官指数参考王思凝等[8]的方法，在42日龄时，各组每个重复随机选取2只鸡，禁食禁水8 h后称重，屠宰摘取胸腺、脾和法氏囊，用电子天平对每只鸡的胸腺、脾和法氏囊称重，计算免疫器官指数。免疫器官指数=免疫器官重量/宰前活体重（2）1.3.5小肠组织结构观察参考侯旭东等[9]的方法，在42日龄时，各组每个重复随机选取1只鸡，屠宰摘取空肠，用10%的甲醛溶液固定，石蜡切片，苏木精伊红染色，用倒置显微镜观察。1.3.6生长性能参考李金凤等[10]的方法，在试验开始及结束时，所有肉仔鸡空腹称重，试验期间记录采食量，计算平均日增重、平均日采食量、料重比。平均日增重=（末重-初重）/天数（3）平均日采食量=总采食量/天数（4）料重比=平均日采食量/平均日增重（5）1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1松花粉对肉仔鸡血清鸡新城疫抗体水平的影响（见表2）由表2可知，21日龄时，与KB组相比，YX组及各松花粉添加组鸡血清新城疫抗体滴度均极显著升高（P0.01）。SHF 2 g/kg组新城疫抗体滴度显著高于SHF 1 g/kg组和SHF 4 g/kg组（P0.05）。28日龄时，与YX组、SHF 2 g/kg组和SHF 4 g/kg组鸡血清新城疫抗体滴度均极显著升高（P0.01）。SHF 2 g/kg组新城疫抗体滴度极显著高于SHF 1 g/kg组和SHF 4 g/kg组（P0.01）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.006.T002表2松花粉对肉仔鸡血清鸡新城疫抗体水平的影响Tab.2Effect of pine pollen on serum antibody level of Neomyces pestilence in broilers组别21日龄28日龄35日龄42日龄KB组4.80±0.63Bc6.40±0.52Cc6.60±0.52Cc5.40±0.52CcYX组6.90±0.88Aab8.10±0.88ABab8.40±0.52ABab7.00±0.47ABabSHF 1 g/kg组6.70±0.48Ab6.70±0.48Cc8.10±0.57Bb6.80±0.63ABabSHF 2 g/kg组7.30±0.48Aa8.40±0.70Aa8.90±0.74Aa7.30±0.48AaSHF 4 g/kg组6.60±0.52Ab7.60±0.70Bb7.90±0.74Bb6.60±0.70Bb注 ：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。35日龄，与KB组相比，YX组及各松花粉添加组鸡血清新城疫抗体滴度均极显著升高（P0.01）。SHF 2 g/kg组新城疫抗体滴度极显著高于SHF 1 g/kg组和SHF 4 g/kg组（P0.01）。42日龄，与KB组相比，YX组及各松花粉添加组鸡血清新城疫抗体滴度均极显著升高（P0.01）。SHF 2 g/kg组新城疫抗体滴度极显著高于SHF 4 g/kg组（P0.01）。结果表明，松花粉能够提高鸡血清新城疫抗体的效价，以SHF 2 g/kg组效果最佳。2.2松花粉对肉仔鸡外周血淋巴细胞增殖情况的影响（见表3）由表3可知，与KB组相比，YX组及各SHF添加组肉仔鸡外周血淋巴细胞的刺激指数均极显著升高（P0.01）。SHF 2 g/kg组肉仔鸡外周血淋巴细胞的刺激指数极显著高于SHF 4 g/kg组（P0.01），显著高于SHF 1 g/kg组（P0.05）。结果表明，松花粉能够促进外周血淋巴细胞的增殖，以SHF 2 g/kg组效果最佳。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.006.T003表3松花粉对肉仔鸡外周血淋巴细胞增殖情况的影响Tab.3Effects of pine pollen on lymphocyte proliferation in peripheral blood of broilers项目KB组YX组SHF 1 g/kg组SHF 2 g/kg组SHF 4 g/kg组淋巴细胞刺激指数1.00±0.00Cc1.45±0.01Aa1.23±0.13ABb1.45±0.06Aa1.19±0.15Bb注 ：同行数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.3松花粉对肉仔鸡外周血细胞因子含量的影响（见表4）由表4可知，与KB组相比，YX组及各SHF添加组肉仔鸡外周血中IFN-γ、IL-2、IL-4的含量均极显著升高（P0.01）。SHF 2 g/kg组外周血中IFN-γ、IL-4含量极显著高于SHF 1 g/kg组和SHF 4 g/kg组（P0.01）；SHF 2 g/kg组外周血中IFN-γ含量极显著高于YX组（P0.01），IL-4含量显著高于YX组（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.006.T004表4松花粉对肉仔鸡外周血细胞因子含量的影响Tab.4Effects of pine pollen on cytokine content in peripheral blood of broilers组别IFN-γIL-2IL-4KB组33.26±1.22C41.37±1.72B34.07±1.23CcYX组41.65±2.06B50.18±3.45A42.95±1.23ABbSHF 1 g/kg组41.63±2.22B49.01±3.22A41.13±2.90BbSHF 2 g/kg组46.99±1.87A50.05±1.77A48.39±1.10AaSHF 4 g/kg组40.58±2.32B48.20±3.31A42.20±2.84Bbng/L结果表明，松花粉能够提高肉仔鸡外周血中IFN-γ、IL-2和IL-4的含量，以SHF 2 g/kg组效果最佳。2.4松花粉对肉仔鸡免疫器官指数的影响（见表5）由表5可知，与KB组相比，YX组及各SHF添加组肉仔鸡胸腺指数、法氏囊指数、脾脏指数均极显著升高（P0.01）。SHF 2 g/kg组胸腺指数、法氏囊指数极显著高于YX组、SHF 1 g/kg组和SHF 4 g/kg组（P0.01），脾脏指数显著高于SHF 4 g/kg组（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.006.T005表5松花粉对肉仔鸡免疫器官指数的影响Tab.5Effects of pine pollen on immune organ index of broilers组别胸腺指数法氏囊指数脾脏指数KB组2.32±0.26C3.36±0.16C2.22±0.15BcYX组2.95±0.19B3.79±0.19B2.63±0.15AabSHF 1 g/kg组2.94±0.10B3.77±0.14B2.56±0.13AabSHF 2 g/kg组3.18±0.20A4.25±0.12A2.73±0.14AaSHF 4 g/kg组2.79±0.24B3.75±0.16B2.54±0.14Ab结果表明，松花粉能够提高肉仔鸡的胸腺指数、法氏囊指数、脾脏指数，以SHF 2 g/kg组效果最佳。2.5松花粉对肉仔鸡空肠组织结构的影响（见图1~图5）XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.006.F001图1KB组肉仔鸡空肠组织结构Fig.1Structure of jejunum of broilers in KB groupXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.006.F002图2YX组肉仔鸡空肠组织结构Fig.2Structure of jejunum of broilers in YX groupXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.006.F003图3SHF 1 g/kg组肉仔鸡空肠组织结构Fig.3Structure of jejunum of broilers in SHF 1 g/kg groupXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.006.F004图4SHF 2 g/kg组肉仔鸡空肠组织结构Fig.4Structure of jejunum of broilers in SHF 2 g/kg group由图1~图5可知，YX组、SHF 1 g/kg组、SHF 2 g/kg组和SHF 4 g/kg组肉仔鸡空肠小肠绒毛增长，隐窝加深。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.006.F005图5SHF 4 g/kg组肉仔鸡空肠组织结构Fig.5Structure of jejunum of broilers in SHF 4 g/kg group2.6松花粉对肉仔鸡生长性能的影响（见表6）由表6可知，与KB组相比，YX组、SHF 1 g/kg组和SHF 2 g/kg组鸡末重、平均日增重均极显著升高（P0.01）。SHF 2 g/kg组末重显著高于SHF 1 g/kg组和SHF 4 g/kg组（P0.05），平均日增重显著高于SHF 4 g/kg组（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.006.T006表6松花粉对肉仔鸡生长性能的影响Tab.6Effects of pine pollen on growth performance of broilers组别初重/g末重/g平均日增重/[g/(只·d)]平均日采食量/[g/(只·d)]料重比KB组41.03±4.092 111.00±75.53Cc48.28±1.86Cc93.78±1.64Aa1.92±0.10AaYX组39.57±1.032 817.30±132.94Aa65.14±3.18Aa92.02±0.31ABab1.40±0.07BdSHF 1 g/kg组39.48±2.482 479.00±86.41Bb57.08±2.12Bb91.76±0.48ABab1.59±0.05BcSHF 2 g/kg组41.45±3.192 682.30±94.19ABa61.88±2.28ABab89.90±1.51Bb1.44±0.06BdSHF 4 g/kg组40.54±3.582 257.70±33.00BCc51.79±0.71BCc92.45±0.46ABa1.76±0.03ABb与KB组相比，YX组、SHF 1 g/kg组和SHF 2 g/kg组料重比均极显著降低（P0.01），SHF 4 g/kg组显著降低（P0.05）。SHF 2 g/kg组料重比显著低于SHF 1 g/kg组和SHF 4 g/kg组（P0.05）；SHF 2 g/kg组平均日采食量极显著低于KB组（P0.01），显著低于SHF 4 g/kg组（P0.05）。结果表明，松花粉能够提高鸡末重、平均日增重和平均日采食量，降低料重比，以SHF 2 g/kg组效果最佳。3讨论3.1松花粉对肉仔鸡免疫功能的影响机体免疫功能通过免疫器官、免疫细胞和免疫分子实现，免疫器官指数在一定程度上可反映相应器官功能的强弱。淋巴细胞是免疫活性细胞，只有接受抗原刺激后才能够分化增殖，产生特异性免疫应答，参与机体体液免疫和细胞免疫应答。Bing等[11]研究发现，松花粉多糖可以增加免疫器官的指数。Yang等[12]通过试验表明，松花粉多糖作为免疫佐剂可有效增强鸡外周血淋巴细胞的免疫活性。此外，松花粉多糖可改善细胞因子水平等免疫指标，能够影响免疫抑制动物的免疫功能[13]。刘娜等[14]研究表明，泰山松花粉多糖对新城疫-禽流感二联灭活苗的免疫效果具有明显的增强作用。本研究结果显示，松花粉能够促进鸡新城疫抗体产生，促进外周血中淋巴细胞的增殖及细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ分泌，提高胸腺指数、法氏囊指数和脾脏指数。结果表明，松花粉能够激活淋巴细胞，激活的淋巴细胞分裂增殖，提高免疫器官重量，从而提高免疫器官指数。激活的淋巴细胞还能够分泌抗体和细胞因子，从而提高机体的免疫功能。3.2松花粉对肠道结构的影响小肠是消化和吸收的主要部位[15]。小肠肠管长，小肠黏膜形成许多皱褶，黏膜上皮和固有层突入肠腔形成小肠绒毛；而且小肠黏膜上皮为单层柱状上皮，柱状细胞表面具有微绒毛，上述条件均可增大消化吸收面积。小肠绒毛越发达消化和吸收能力越强。在小肠黏膜上皮凹陷到固有层形成隐窝，隐窝越深，分泌小肠液越多，化学性消化功能越强。本研究结果表明，松花粉能够肉仔鸡空肠小肠绒毛增长，隐窝加深，可能由于松花粉能够改善肠道环境，利于小肠发育。3.3松花粉对肉仔鸡生长性能的影响动物的生长性能对养殖经济效益具有重要作用[16]。Shang等[17]研究发现，松花粉多糖可以改善病毒引起的鸡生长发育不良。崔鹤馨等[18]研究发现，泰山松花粉多糖可以提高仔猪生长性能、改善肠道细菌及提高消化道淀粉酶活性。本研究结果显示，松花粉能够提高鸡末重、平均日增重和日采食量，降低料重比。本研究结果可能与下列因素有关：松花粉是糖类物质，能够增强动物的适口性，进而提高平均日采食量，而且松花粉本身作为能量物质能够促进动物生长发育；此外，松花粉能够提高肉仔鸡的免疫功能，保证机体健康从而促进生长发育；松花粉能够使小肠绒毛增长，隐窝加深，提高消化和吸收能力。生长发育好，平均日增重升高，料重比随之降低。4结论本研究结果显示，松花粉能够促进鸡新城疫抗体的产生，促进外周血中淋巴细胞的增殖及细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ分泌，提高胸腺指数、法氏囊指数和脾脏指数，从而提高鸡的免疫功能；松花粉能够提高空肠小肠绒毛长度和隐窝深度，从而提高鸡的消化吸收功能；能够提高末重、平均日增重和平均日采食量，降低料重比。结果表明，松花粉能够提高肉仔鸡的免疫功能，改善肠道结构，提高生长性能，以SHF 2 g/kg组效果最佳。