无形体属（Anaplasma）属于立克次体目（Rickettsiales）无形体科（Anaplasmataceae），是一种专性、胞内寄生的革兰氏阴性菌。无形体病原呈桑葚状，常以包涵体形式繁殖，大小为0.2~1.5 µm，能够由多种节肢动物传播，并侵染人和动物的粒细胞、单核细胞、红细胞和血小板，是影响畜牧业的重要病原体[1]，其中绵羊无形体是家养动物中普遍存在的病原体。绵羊无形体最早于1912年在绵羊中发现，广泛分布于亚洲、欧洲和非洲，并已在山羊、绵羊、牛、天山马鹿和一些野生反刍动物中发现[2-6]。无形体经常在小型反刍动物中持续感染，尤其是老年、营养不良、免疫功能受损和慢性衰弱的动物[7]。无形体病常见的临床表现包括发热、疲劳、厌食、进行性贫血、黄疸、体重减轻、产奶量减少、流产和寿命缩短[7-8]。新疆占地约1 660 000 km2，地貌类型多样化，包括9种地貌类型，覆盖除海洋地貌类型外的全部地貌特点。新疆南部地区面积约1 020 000 km2，被多种陆地形式包围，包括戈壁沙漠、山谷、山脉、草原和平地。复杂的地理环境适合多种节肢动物生长，易于各种潜在疾病传播。为了解新疆南部多地绵羊中绵羊无形体流行情况及基因型分布，本试验采用分子生物学方法，调查新疆南部6个地区绵羊中绵羊无形体感染情况，为新疆南部地区绵羊无形体的防控监测提供参考。1材料与方法1.1样品收集于2019年5月至10月和2020年5月至9月分别从和田市、阿拉尔市、乌苏市、库车市、泽普县、巴楚县采样，每个地点分别采集20份成年雌性绵羊血液和20份60~90日龄羔羊血液样本，分别装入含有EDTA的试管中。共计采集240份全血样本，并严格记录样本数据，放入冷冻保温箱中运送至实验室-20 ℃保存。1.2主要试剂血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、2×Taq Plus PCR Mix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司，2000 DNA Marker、核酸染料GelStain购自北京全式金生物技术有限公司。1.3血液样本DNA提取及无形体msp4基因PCR扩增利用DNA提取试剂盒提取240份绵羊全血样本的DNA，提取后保存在-20 ℃直至分析。根据绵羊无形体msp4基因[9]种特异性引物进行PCR扩增。总反应体系（25 µL）：2×Taq Plus PCR Mix 13 µL、去离子水9 µL、绵羊无形体引物（最终浓度为10 µmol/L）1 µL和模板DNA1 µL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。为进行质量控制，使用无菌超纯水作为阴性对照以监测污染。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，利用凝胶成像仪进行可视化查看。将阳性样本寄送至苏州金唯智有限公司进行回收纯化和双向测序，将双向测序后的数据应用DNAstar软件进行拼接，拼接后在NCBI进行Blast比对。1.4绵羊无形体msp4基因氨基酸和遗传进化分析使用DNAstar、DNAman软件从相应的基因组序列推导出绵羊无形体氨基酸序列，并使用MEGA 7.0进行氨基酸序列比对。在MEGA7.0中使用最大似然算法，自展值设置为1000构建系统进化树。本研究中获得的核苷酸序列保存在GenBank数据库中（OP503165~OP503167）。2结果与分析2.1绵羊无形体流行情况调查结果（见图1、表1~表3）由图1可知，2019年—2020年6个地区采集的240份绵羊血液样本，以msp4基因为靶点进行PCR检测，部分扩增出大小约为867 bp的目的片段，与预期片段大小一致。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.015.F001图1羊绵羊无形体msp4基因PCR电泳结果Fig.1PCR electrophoresis results of msp4 gene of A. ovis注：M为DL2000；1~9为样品；10为阴性对照。由表1可知，在54份血液样本中发现绵羊无形体DNA（阳性率22.5%），利用Blast对基因组序列进行分析和比较，所有序列均被确认为绵羊无形体。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.015.T001表1新疆南部各地区样本绵羊无形体感染情况Tab.1Anaplasma ovis infection in sheep samples from various regions of southern Xinjiang采样点年份样品总数/份阳性数/份合计阳性率/%95%置信区间和田2019401435.019.6~50.4阿拉尔40410.00.3~19.7乌苏202040922.59.0~36.0库车401025.011.0~39.0泽普401537.521.8~53.2巴楚4025.01.1~8.9合计2405422.517.2~27.8由表2、表3可知，在120份成年雌性绵羊血液样本中发现45份存在绵羊无形体DNA（阳性率37.5%），羔羊血液样本检测结果见9份阳性（阳性率7.5%）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.015.T002表2成羊感染绵羊无形体3种基因型流行情况Tab.2Prevalence of three genotypes of adult sheep infected with Anaplasma ovis采样点样本数/份基因Ⅱ型基因Ⅲ型基因GB3型合计阳性率/%阳性数/份95%置信区间阳性率/%阳性数/份95%置信区间阳性率/%阳性数/份95%置信区间阳性率/%阳性数/份95%置信区间合计12010.0124.6~15.425.03017.1~32.92.530~5.337.54528.7~46.3和田2020.040.8~39.230.068.0~52.010.020~24.460 01236.5~83.5阿拉尔2000—20.040.8~39.200—20.040.8~39.2乌苏2025.054.2~45.810.020~24.400—35.0712.1~57.9库车2010.020~24.435.0712.1~57.900—45.0921.1~68.9泽普2000—55 01131.1~78.900—55.01131.1~78.9巴楚205.010~15.500—5.010~15.510.020~24.4注 ：“—”表示未发生感染，下表同。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.015.T003表3羔羊感染绵羊无形体3种基因型流行情况Tab.3Prevalence of three genotypes of lamb infected with Anaplasma ovis采样点样本数/份基因Ⅱ型基因Ⅲ型基因GB3型合计阳性率/%阳性数/份95%置信区间阳性率/%阳性数/份95%置信区间阳性率/%阳性数/份95%置信区间阳性率/%阳性数/份95%置信区间合计1200.810~2.55.061.0~9.01.720~4.07.592.7~12.3和田2000—5.010~15.55.010~15.510.020~24.4阿拉尔2000—00—00—00—乌苏205.010~15.55.010~15.500—10.020~24.4库车2000—5.010~15.500—5.010~15.5泽普2000—15.030~32.15.010~15.520.040.8~39.2巴楚2000—00—00—00—绵羊无形体不同基因型调查结果显示，成年绵羊45份绵羊无形体阳性样本中包括3种基因型，其中12份为基因Ⅱ型、30份为基因Ⅲ型、3份为基因GB3型；羔羊中仅检测到少量不同基因型，基因Ⅱ型为1份、基因Ⅲ型为6份、基因GB3型为2份。240份样本中个基因型感染情况分别为基因Ⅱ型13份（阳性率5.4%）、基因Ⅲ型36份（阳性率15.0%）、基因GB3型5份（阳性率2.1%）。2.2绵羊无形体基因序列比对分析（见图2、图3）氨基酸序列比对显示，核苷酸变化导致氨基酸变化。由图2（a）可知，根据已知绵羊无形体基因Ⅰ型为核苷酸基准序列进行比较，发现sheepXJ3在376号位点发生碱基改变，与已知基因Ⅲ型碱基相同；sheepXJGB3序列比较显示，碱基改变发生在240和376号位点，与GB3基因型同位点发生变化；sheepXJ2序列碱基改变位点为376和480位点与基因Ⅱ型相一致，本次调查序列全长为867 bp，其余位点与基因Ⅰ型均相同。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.015.F002图2绵羊无形体msp4基因核苷酸(A)和氨基酸(B)序列的差异Fig.2Differences in msp4 gene nucleotide (A) and aminoacid (B) sequences among Anaplasma ovis注 ： 框内表示本研究获得序列与已知序列比较在相同位点发生改变情况，“∙”表示未发生改变，与A. ovis基因Ⅰ型相同。由图2（b）可知，氨基酸比对同样使用绵羊无形体基因Ⅰ型为基准序列，发现仅sheepXJGB3序列由于核苷酸在270号位点的发生变化，导致氨基酸在80号位点发生改变，并与已知GB3基因型氨基酸序列改变位点相同。本次试验获得的其余基因型氨基酸序列与绵羊无形体基因Ⅰ型多位点比较均未见改变。本研究中所获得的序列之间核苷酸相似性为99.7%~100.0%，氨基酸相似性为99.9%~100.0%，并确定了3种基因型，分别为基因Ⅱ型、Ⅲ型、GB3型。由图3可知，系统发育树显示，sheepXJ3（GenBank登录号：OP503165）与在西西里岛绵羊中分离出的Italy20 A. ovis菌株（GenBank登录号：AY702923）同源性为100%。sheepXJGB3（GenBank登录号：OP503166）与突尼斯绵羊中分离“GB3”A. ovis菌株（GenBank登录号：KC432643）同源性为100%。sheepXJ2（GenBank登录号：OP503167）与西西里岛绵羊分离“Italy147”A. ovis菌株（GenBank登录号：AY702924）同源性为100%。由此将绵羊无形分类为基因Ⅱ型、Ⅲ型以及GB3型。上述3种基因型与代表基因相互靠近，并且存在明显的种间进化距离。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.015.F003图3绵羊无形体基于msp4基因的系统进化树Fig.3Phylogenetic tree of Anaplasma ovis based on msp4 gene3讨论无形体属是影响人类生命活动和动物健康的重要病原体，并在动物中广泛存在。目前全球已公认存在8种无形体，包括绵羊无形体（A. ovis）、牛无形体（A. bovis）、边缘无形体（A. marginale）、嗜吞噬细胞无形体（A. phagocytophilum）、血小板无形体（A. platys）、中央无形体（A. centrale）、尾鹿无形体（A. odocoilei）和山羊无形体（A. capra）。无形体病主要由蜱虫以及多种节肢动物动物叮咬宿主嗜血而传播。目前已确定感染人类的无形体有嗜吞噬细胞无形体、山羊无形体、血小板无形体、绵羊无形体变种[1,10-12]。在畜牧业生产中绵羊无形体、牛无形体和嗜吞噬细胞无形体是最为常见的病原体，同时也是对公共卫生安全危害最大的病原体。在本研究中使用msp4基因对绵羊血液样本中的绵羊无形体进行鉴定，通过常规PCR和测序方式证实在新疆南部地区养殖的绵羊中存在绵羊无形体DNA。不同绵羊无形体菌株中存在msp4基因序列的变异，本研究中所发现的绵羊无形体序列被分类为3个绵羊无形体基因型。目前已知绵羊无形体定义为13种基因型。2002年，de la Fuente等[13]在美国为检测边缘无形体在蜱虫细胞中的感染作用，通过进行绵羊无形体感染蜱虫细胞对边缘无形体是否发生排斥的试验发现了第一个绵羊无形体的基因型。2005年，在意大利西西里岛绵羊血液中发现基因Ⅱ和Ⅲ型。2007年，在美国大角羊中分离出基因Ⅳ型，在骡鹿中发现基因Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ型。2014年，在突尼斯绵羊的血液中发现存在两种新的基因型GB3和GK1。2015年，在突尼斯比塞大省绵羊中发现AoGOv2、AoGOv3和AoGOv4基因型。2022年，在孟加拉国山羊血液样本中发现一种新的未定名的基因型Ao.cvasu 1[14-15]。2010年，Chochlakis等[12]在塞浦路斯报道第一例绵羊无形体变体感染人类的病例，但由于该研究并未进行HL-60和THP-1细胞接种，关于绵羊无形体感染人的相关机制仍饱受争议。我国主要在新疆、宁夏、内蒙古、甘肃、陕西和安徽等地均有绵羊无形体相关病例的报道。根据序列比对可知，在以往我国多地报道中基因Ⅲ型是主要流行基因型，本试验结果也证实了这一观点。2017年，Song等[14]在新疆采集的多种硬蜱中检测到绵羊无形体基因Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型。2018年，Zhao等[16]在新疆南部绵羊体表收集的成年羊蜱蝇和蛹中均检测到绵羊无形体DNA，并且发现这些阳性样本属于基因Ⅱ型和Ⅲ型。新疆地理环境复杂，适合多种体外寄生虫的生存，由于体外寄生虫可携带多种病原体，导致多种家畜暴露在被体外寄生虫叮咬的风险下，使得多种病原体易于传播。现有研究表明，多种蜱虫是绵羊无形体主要的载体宿主，能够通过叮咬将病原体传播给宿主动物。然而绵羊无形体一般引起动物感染表现出轻微的临床症状，极易被忽视。根据以往的研究报告显示，动物一旦感染无形体可能会成为该病原体的终身宿主，从而产生PCR结果阳性的反应[17]。本试验结果显示，成年绵羊中绵羊无形体流行率较高，这可能由于地理条件因素而导致外寄生虫叮咬传播而引起的长期携带；羔羊血液样本中绵羊无形体检出率极低，表明羔羊在哺乳期能够抵抗该种病原体的侵袭。有相关研究表明，无形体不能在动物中垂直传播，并且新生羔羊在哺乳期通过初乳获得的抗体能够发挥重要作用[18]。个别羔羊出现感染情况，其主要原因是个别断乳期绵羊受外界环境因素而导致的叮咬传播。4结论本研究报告了来自新疆南部6个地区的绵羊中无形体病原的流行率，结果显示，新疆南部地区绵羊血液中存在3种基因型，其中基因Ⅲ型是本地区主要流行基因型，基因Ⅱ型流行率不断提高，基因GB3型流行率相对较低。本研究结果有助于补充绵羊无形体的现有流行病学信息，并为新疆维吾尔自治区家畜绵羊无形体的预防和控制提供关键信息，后续有必要进一步研究不同基因型无形体对于绵羊致病性的影响。