抗体作为抵御外来病原入侵第一道防线，是构成适应性免疫极其重要的一部分。抗体对机体外来生物及分子作出反应，并最终能够中和或消除这些生物及分子。抗体具有对特定抗原高度亲和力，并且具有能够特异性结合抗原的能力，因而广泛应用于各类医学学科及相关科学研究中[1]。多克隆抗体的制备相较于其他抗体制备方式更加简单，而且抗体制备数量较多，一般过程为抗原筛选、试验动物选择、获取抗血清并对血清进行纯化。本文主要对多克隆抗体的制备过程与方法以及多克隆抗体在动物生产中的应用进行综述，为制备针对多种动物病毒或不同应用目的的多克隆抗体提供试验思路与方法。1多克隆抗体的制备由于抗原结构复杂，可被大量淋巴细胞识别，因此多克隆抗体通常由识别抗原不同表位的抗体组成。与单克隆抗体由单个B淋巴细胞识别抗原表位并分泌特异性抗体不同，多克隆抗体由不同B淋巴细胞识别抗原表位并产生。每个淋巴细胞被不同的抗原表位刺激增殖后分化成浆细胞，因此多个淋巴细胞产生的抗体是多克隆抗体。在间接免疫中，通过多克隆抗体的结合放大目标抗原的生物信号。向宿主动物注射抗原后，体液免疫反应产生不同种类的免疫球蛋白。常见动物如兔子、鸡和羊驼具有不同的抗体结构和类型。制备多克隆抗体时免疫方案包括初始免疫，之后根据一定时间进行一次或多次加强免疫，一般时间为1~3个月即可获得一定数量的多克隆抗体，较理想的多克隆抗体是从单一抗原中获得最多抗原表位的抗体。1.1抗原选择抗原可通过多种方式制备获得，如使用抗原提取剂提取目的抗原，人工合成多肽以及通过基因工程制备抗原[2]。1.1.1原核表达系统经过改造的工程菌可对不同来源的蛋白质进行表达，因此其成为进行抗体制备时较为常用表达抗原蛋白的方法。但在进行蛋白表达前，应详细了解表达蛋白的序列与结构等，可能还要进行相应改造以提高蛋白表达量。由于原核表达系统中，不同条件均可影响抗原蛋白的生成速率。蛋白生成速率过快时，抗原蛋白无法进行正确折叠，会形成包涵体蛋白（也称不可溶性蛋白）。包涵体蛋白没有与可溶性蛋白相似的正常蛋白结构，因此需要对包涵体蛋白进行变性后再次进行复性才可作为免疫原。在选择免疫原时，应尽可能选择大肠杆菌表达的可溶性蛋白。可溶性蛋白经过正确折叠且能够更好地还原在细胞内的蛋白形态，使制备的抗体可更好地与蛋白进行反应。在无法获取可溶性蛋白的情况下，包涵体蛋白也可以作为抗原进行免疫，但是产生的抗血清中杂质较多，可能会与多种蛋白发生反应。原核表达系统制备抗原蛋白时，选择能够提高蛋白可溶性及正确翻译并修饰蛋白序列的表达系统。使用带有谷胱甘肽S转移酶（GST）标签的pGEX4T质粒表达系统能够增加蛋白的可溶性，提高蛋白表达量[3]。但是在进行动物免疫时需切除GST标签，以避免动物对GST标签产生抗体干扰试验结果。表达真核蛋白时，可对蛋白序列进行密码子优化或选择表达真核蛋白的菌株，如Rosetta（DE3）plysS菌，此菌株中补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子（AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA）对应的tRNA，可以提高真核基因在原核系统中的表达水平。1.1.2酵母表达系统酵母表达系统结合多种表达系统的优点，即使单个细胞也能够进行快速增殖并更改其遗传信息，表达外源蛋白操作简单，而且酵母能够对真核生物蛋白翻译并修饰。通过生长过程中是否需要添加甲醇可将酵母分为甲醇酵母及非甲醇酵母[4]。毕赤酵母作为甲醇营养型酵母表达系统，在氮和碳源的培养基不能表达蛋白，只能利用甲醇对其进行诱导。毕赤酵母蛋白表达系统依赖醇氧化酶-1（AOX1）、醇氧化酶-2（AOX2），这两个基因的添加使毕赤酵母能够利用甲醇与油酸大量表达外源蛋白；更改甲醇与油酸的添加量可显著提高外源蛋白的表达量[5]。毕赤酵母中外源基因的表达受到多种因素的影响，主要包括外源基因的性质和毕赤酵母培养条件两个方面。外源基因的性质主要包括UTR序列、A+T含量、密码子和基因拷贝数等[6]。1.1.3其他表达系统除了原核表达系统与酵母表达系统外，昆虫表达系统、哺乳动物细胞表达系统以及牛奶表达系统均可对外源蛋白进行表达，应用技术已经较为成熟。1.2宿主动物的选择多克隆抗体由哺乳动物的骨髓和禽类法氏囊的多个淋巴B细胞产生，具有不同的特异性和表位亲和性。不同物种之前的免疫系统存在一定差异。而对于蛋白抗原，B淋巴细胞的活化需要辅助性T细胞参与，也需要树突状细胞和巨噬细胞（抗原提呈细胞或APCs）的参与[7]。在选择宿主动物时应注意抗原与宿主动物同源性，所需抗体的数量及取样是否方便等。若抗原是高度保守蛋白，那么宿主动物机体可能会由于无法识别抗原而不产生特异性抗体。一般在进行多克隆抗血清制备时，目的是获取大量抗体进行后续试验，选用家兔或鸡作为宿主动物可获取大量血清。选择试验动物时，更值得注意的一点是试验动物年龄的选择，一般成年后的试验动物免疫系统更加健全，可对外来免疫原产生积极应答并且产生大量抗体。1.2.1家兔家兔作为制备多克隆抗体时的首选试验动物具有诸多优点：抓取方便、容易操作，而且单次获得血清数量较多，单次抽血10~20 mL不会产生较大影响，在饲养情况良好且操作适宜的情况下可获取500 mL血清；免疫系统较为特殊，针对免疫原时只产生IgG类抗体。进行相关试验时，一般选择14周龄以上的雌兔进行免疫，首次免疫抗原500~1 000 μg加强免疫2~3次即可产生大量抗血清。1.2.2禽类当抗原与宿主动物之间存在同源性时，推荐生产多克隆卵黄抗体[8-9]，卵黄中含有大量的抗体（比同等体积的兔血清多5~6倍）。选择鸡为宿主动物时应考虑提取效果（保存活性、纯度和抗体回收率），多克隆抗体抗体纯化步骤所需的设备成本也是一个需要考虑的因素。1.2.3啮齿类动物小鼠作为最常用的试验动物之一，也常用于制备多克隆抗体。使用小鼠制备抗血清时，每只小鼠可用血量只有0.5~1.0 mL；但对于抗体特异性要求较高时，可使用经过特殊培养的小鼠品系进行试验或选用大鼠、豚鼠等体型稍大的啮齿类动物。当抗原制备数量较少时，也可以选择使用啮齿类动物进行试验，通常啮齿类动物对少量抗原即可产生较好的免疫反应。1.2.4驼科动物驼科外周血中存在一种只有轻链构成的单域抗体，其分子量仅为12~15 kDa，比普通抗体小得多。单域抗体又称纳米抗体，能够与“隐蔽”表位相结合，而较大的抗体可能无法与酶的活性位点结合，如传统的IgG抗体；纳米抗体还能够穿透难以进入的组织，如肿瘤组织；并可在没有任何转运体的帮助下穿过血脑屏障[10]。驼科动物产生的纳米抗体对极端pH值和温度具有很高的耐受性，不易变性的特点使得纳米抗体的应用更加广泛。2多克隆抗体在动物医学中的应用2.1传染性法氏囊病传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的高度传染性禽类免疫抑制性疾病。IBDV感染可导致淋巴器官法氏囊中的B细胞坏死从而引起免疫系统抑制，继发感染和死亡[11]。尽管开发各种诊断方法以及用于预防该疾病的重组DNA-IBDV疫苗[12]，但由于突变体的出现，IBD仍然是严重损害家禽业的首要原因[13]。抗IBDV多克隆抗体能够预防感染，降低感染IBD幼鸡病死率并能够减轻感染法氏囊组织病变程度[14-15]。当特异性多克隆抗体与IBDV疫苗（D78）组合使用时，保护作用最显著[12]。2.2呼肠孤病毒呼肠孤病毒感染家禽可导致相关疾病，如吸收不良综合征、免疫抑制、心包炎、心肌炎和骨质疏松症的关节炎等[16]。虽然目前已开发出几种针对禽呼肠孤病毒的商业疫苗，但无法对感染新型呼肠孤病毒株的鸡群进行检测和治疗[17]。针对禽呼肠孤病毒的特异性多克隆抗体对病毒具有高度敏感性，不仅能够检出感染禽类组织中病毒，中和细胞培养的病毒，且不与异源病毒株发生反应[18]。2.3牛呼吸道合胞病毒牛呼吸道合胞病毒（BRSV）属于副黏病毒科，常感染幼犊，因病毒的不稳定性及在细胞培养中生长不良而难以诊断及治疗[19]。然而，在蚀斑试验和病毒中和试验中，抗BRSV多克隆抗体在体外能够特异性识别并中和病毒[19]，因此多克隆抗体可能成为一种新型预防牛呼吸道疾病的治疗方法。2.4牛白血病病毒牛白血病病毒（BLV）是一种逆转录病毒，能够导致牛内源性白血病，是一种慢性疾病[20]。虽然大多数动物感染后呈隐形经过，但部分动物感染此病毒后可发展为淋巴肉瘤或持续性淋巴细胞增多症。BLV通过分娩和受污染的初乳、牛奶、血液等方式传播[21]。由于尚无有效的抗病毒药物和疫苗，目前减少BLV传播的方式只能做好牛群饲养管理[21]。针对BLV病毒、纯化的p24或自然感染动物外周血产生的多克隆抗体能够对BLV全病毒产生特异性反应[22]，因此抗BLV多克隆抗体可以作为一种针对牛白血病病毒的被动免疫方式。3多克隆抗体在生物医学上的应用19世纪90年代，人们开始利用高免血清治疗急性白喉引起的急性呼吸道感染。在接下来的几十年中，医学界将动物来源的多克隆抗体治疗肺炎、猩红热及球菌性脑膜炎等疾病，然而疾病的类型、发病程度与抗体的种属差异等因素均会影响最后的治疗效果。基于新兴技术的发展，多克隆抗体不仅作为常规检测抗体应用于各种试验，也被应用于不同疾病的治疗中。3.1超免疫多克隆抗体（pAb）疗法来自血清的多克隆抗体是目前首选也是唯一的治疗方法，用于特定的紧急医疗情况。多克隆抗体能够消除复杂、特征不明确的靶抗原混合物。纯化后多克隆抗体通常会使用特异性蛋白酶（如木瓜蛋白酶[23]或胃蛋白酶）消化，并进一步纯化特异性抗原结合片段（Fabs），以去除Fc片段和其他杂质和污染物。Cro FabTM用于治疗响尾蛇中毒，自2000年12月发布以来极大地改变了蛇咬伤管理。Cro FabTM已被证明在治疗局部蛇毒中毒[23]的和全身毒性作用方面非常有效。3.2多克隆抗体注射疗法多克隆疗法是通过对蛋白的选择性分离和纯化，从人血液中分离血浆或血浆衍生物[24]。用于静脉注射的多克隆免疫球蛋白是从数百至数千个血液样本中获得的血浆中进行大规模纯化。静脉注射多克隆抗体（IVIG）多年来一直用于治疗抗体缺陷患者，这些患者可能是由于遗传疾病或治疗等原因导致；多克隆免疫球蛋白被证明是原发性免疫缺陷综合征患者的有效治疗方法[25-26]。3.3生物防御多克隆抗体在治疗炭疽、天花等方面显示出巨大的潜力，可以模仿自然发生的被动免疫，从而对包括白喉、破伤风、链球菌和腮腺炎在内的多种病原体提供保护[27]。多克隆抗体疗法的优势在于无疫苗的情况下或在免疫反应水平较低的情况下，接触有毒物质时多克隆抗体就会提供初步保护。抗体通常在初次免疫后10~14 d达到峰值，有效保护可能需要重复免疫以保持高水平的中和抗体。使用针对致病因子的特异性多克隆抗体或片段进行被动免疫的优点在于接触致病菌或病毒后立即提供临床保护[28]。单克隆抗体因其靶向性高、特异性强的特点常应用于治疗肿瘤等疾病[29]，但起作用范围也较为局限；高纯度的多克隆抗体能够对目标蛋白进行特异性结合并作用于目标蛋白的不同靶点。最近，利用肿瘤反应性噬菌体展示文库制备用于结直肠癌治疗的重组多克隆抗体也有报道[30]。4结论抗体治疗作为一种预防及治疗手段已经有上百年历史，随着抗体研究不断深入，现已开发出依托多克隆抗体与单克隆抗体的生物制剂及靶向药物。多克隆抗体具有作用时间长、作用范围广等特点，随着抗体制备手段不断发展，多克隆抗体在动物医学中的应用前景将更加广阔。