链球菌病是一种对各年龄段猪广泛易感的细菌性人畜共患疾病，致病率和致死率较高，一旦暴发可造成养殖业巨大经济损失，严重威胁公共卫生安全。辽宁省是养猪大省，铁岭地区是重要的猪养殖地。为加强对辽宁省重点地区猪链球菌病的监测，了解铁岭地区猪链球菌病流行菌株及其生长特性，本试验以铁岭地区的送检病料为研究对象，对病原菌株进行分离培养，并建立分离株的生长曲线，以期为猪链球菌病诊断和相关疫苗研究提供一定参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌株从铁岭地区17个规模猪场送检的猪链球菌（SS）疑似病例肺脏、肝、脾、脑、关节液等样品中采集样本，共82份。1.1.2试验试剂细菌基因组DNA提取试剂盒（杭州博日科技有限公司）、2×Taq Master Mix（北京康为世纪生物有限公司），脑心浸液肉汤（BHI）培养基、胰酪胨大豆肉汤（TSB）培养基、Todd-Hewitt Broth（THB）培养基（青岛海博生物技术有限公司），Gill green核酸电泳染料（华越洋生物科技有限公司）、无水乙醇（分析纯，杭州天和微生物试剂有限公司）、DM2000 DNA Marker（北京康为世纪有限公司）胶回收试剂盒（杭州博日科技有限公司）。1.1.3试验仪器SW-CJ-1FD型超净工作台（苏州净化设备有限公司）、303F-4型恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）、HR/T16MM型冷冻高速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）、DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京市六一仪器厂）、CX21FS1型光学显微镜（OLYMPUS公司）、YX280B型不锈钢压力蒸汽灭菌器（上海三申医疗器械有限公司）、TC-960型PCR基因扩增仪（瑞士Blue Marlin公司）、Tanon-1600型凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）。1.2试验方法1.2.1细菌形态观察与培养将编号病料用接菌环于BHI固体培养基分区划线，37 ℃培养过夜。接种环挑取适量菌落于THB固体培养基上划线，37 ℃培养过夜。继续挑取灰白/黄色圆形单菌落接种于THB固体培养基，反复镜检纯化。纯化后挑单菌落接种于已灭菌的TSB液体培养基，振荡培养约18 h。待菌液浑浊，吸取菌液涂片、革兰染色、镜检，按1∶1比例与50%灭菌甘油混匀后置-80 ℃保存[1-2]。1.2.2模板制备与细菌DNA提取将分离到的疑似菌株在THB固体培养基上划线，37 ℃培养12 h，挑取单菌落接种于TSB液体培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养，12 h后取菌液提取DNA作PCR模板。按照提取试剂盒说明及步骤提取细菌基因组[3]。1.2.3引物设计与扩增根据链球菌属保守基因延长因子Tu（EF-Tu）、猪链球菌血清型特异性基因（SS1型CPS1I、SS2型CPS2J及SS7型CPS7H）设计引物[4-6]，并由上海生工生物工程有限公司合成引物，进行PCR检测。引物序列见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.003.T001表1猪链球菌引物序列Tab.1Primer sequences of Streptococcus suis目的基因引物序列退火温度/℃片段大小/bpEF-TuF:GTACAGTTGCTTCAGGACGTATR:ACGTTCGATTTCATCACGTT60194CPS1IF:GGCGGTCTAGCAGATGCTCGR: GCGAACTGTTAGCAATGAC54441CPS2JF: CGGTTACCAAATGGTGGTGR: ACTTTTGCAGCTCAGATTCTTG55211CPS7HF: GGCAGCTCTAACACGAAATAAGR:TCTTACACAATTGAAGTAATATCG54347PCR反应体系（30 μL）：forward 1 μL、reverse primer 1 μL、模板1 μL、Taq酶1 μL、dNTPs 1 μL、buffer（10×）3 μL、ddH2O 22 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，退火30 s（温度见表1），72 ℃延伸45 s，共30个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物回收纯化后送测序。琼脂糖凝胶电泳，目的条带试剂盒切胶回收，-20 ℃保存。1.2.4猪链球菌生长曲线从-80 ℃保存的14株阳性菌株中，随机选取3株解冻（分别命名为TL01、TL02、TL03）。无菌挑取划线于THB固体培养基复苏，37 ℃恒温培养过夜。用接菌环无菌挑取单菌落，接种于含5%血清的TSB液体培养基，放至37 ℃恒温摇床180 r/min振荡培养。从中分别吸取1 mL放入50 mL 5%血清的TSB液体培养基中，37 ℃ 220 r/min振荡培养，分别在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h分光光度计测定OD600值，绘制生长曲线。2结果与分析2.1细菌形态观察与培养经细菌培养及显微镜形态观察，82份样本中有14份在显微镜下观察到细菌呈椭球形、单个或成双短链排列，无色或浅灰色，半透明，革兰染色阳性。上述条件符合猪链球菌形态特征，未见其余杂菌。2.2序列分析结果（见图1）由图1可知，通过序列比对分析，共分离到14株猪链球菌，样本阳性率约17.07%（14/82）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.003.F001图1疑似样本PCR结果Fig.1PCR results of suspected samples注 ： M为Marker;1~14为疑似样本。2.3猪链球菌生长曲线（见图2）由图2可知，TL01株OD600值在4 h时达到最高，TL02株、TL03株则在5 h时达到最高，3株分离株的生长曲线均基本符合S型生长曲线模型。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.003.F002图23株猪链球菌生长曲线Fig.2Growth curve of three strains of Streptococcus suis3讨论猪链球菌病的病原是猪链球菌，是一种带有荚膜的革兰氏阳性球菌。根据荚膜抗原的不同，临床上可将其划分35种血清型，常见的猪链球菌有10余种。目前国内猪群流行的猪链球菌以1、2、7、9型为主，且临床常与猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV）和副猪嗜血杆菌等发生混合感染，可引起急性败血症、脑膜炎、心内膜炎等病症。猪链球菌经飞沫或伤口碰触均可发生传播，夏季细菌繁殖活跃，冬季猪群聚取暖造成创伤而感染传播。临床上常存在多个血清型猪链球菌的混合感染，同一血清型不同分离株毒力也不一致。猪链球菌感染后潜伏期通常为3~5 d，发病率和致死率较高，可造成巨大经济损失，严重制约养猪业的健康发展[7-9]。此外，人群也可通过养殖、屠宰、餐饮等过程接触感染猪链球菌。1998年江苏省和2005年四川省均暴发过由猪链球菌引起的公共卫生事件，引起了社会广泛关注。目前治疗猪链球菌病首选仍是抗生素。临床上通过药敏试验发现，猪链球菌对各代青霉素较敏感。但抗生素广泛使用导致耐药菌株出现，有研究表明，猪链球菌对四环素、卡那霉素、链霉素、磺胺类、林可霉素等抗药性较强。随着兽用抗菌药减量化行动广泛开展，“养重于防，防重于治”的理念已经逐步深入人心。基于此，猪链球菌病的疫苗研发也提上日程。目前，根据应用对象生长阶段和临诊症状不同，常见市售疫苗有猪链球菌病多价蜂胶灭活苗、猪链球菌病活疫苗、猪链球菌病灭活疫苗（马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型）等。但因养殖环节对于该病疫苗接种并不重视，导致该病一旦暴发会迅速蔓延，故而了解当地猪链球菌病的流行病学特点对于该病防控十分重要[10]。辽宁地区猪链球菌病发生率较为普遍，但该病病理类型比较复杂，临床防治效果并不明显。究其原因是对辽宁各地区猪链球菌的血清型、基因型及耐药性等特性研究不够系统，对特定地区防治方案无针对性。有研究显示，辽宁地区暴发的猪链球菌病病原类型主要是1、2、7型。铁岭作为我省养猪的聚集区之一，做好猪链球菌的分型研究对养猪业发展具有重要意义[11]。本研究选择铁岭地区猪场的送检病料进行研究，涵盖了咽拭子、肺脏、肝、脾、脑、关节液等病料。目前猪链球菌一些毒力因子已被鉴定，包括荚膜多糖、细胞外因子、溶菌酶释放蛋白、溶血素、纤连蛋白结合蛋白、血清浑浊因子、谷氨酸脱氢酶等，其中荚膜被认为是最关键的毒力因子，具有抗吞噬的作用。因猪只能感染1、2、7、9型链球菌，故可通过实验室PCR方法加以鉴别。但若涉及其他物种，如人婴幼儿及灵长类血清1型和14型以及2型和1/2型则无法准确鉴别。通过查阅文献，确定了链球菌属保守基因EF-Tu、猪链球菌血清型特异性基因（SS1型CPS1I、SS2型CPS2J及SS7型CPS7H）进行引物设计，成功建立了猪链球菌主要血清型的PCR检测方法[12-13]。经PCR检测，共筛选出14株阳性菌株；从中盲选3株进行了生长曲线测定，结果基本符合S型生长曲线模型，菌株在接种4 h后左右达到浓度顶峰，随后进入平台期。综上，本研究建立了猪链球菌的诊断方法及菌株生长曲线，为后续该病诊断和相关疫苗研究奠定了一定基础。4结论本研究结果表明，辽宁省铁岭地区存在一定猪链球菌感染情况，本试验成功建立了PCR诊断方法，并绘制3株阳性菌株的生长曲线，为后续该病的诊断和疫苗研究奠定了基础。