五氯酚钠（PCP-Na）是一种含氯高毒有机农药，日常生活中常用作除草剂、木材防腐剂、抗菌剂和杀虫剂等使用[1]。PCP-Na曾在我国消灭南方血吸虫病时大量使用以杀灭中间宿主——钉螺[2]。有研究发现，PCP-Na在酸性环境中容易转化成五氯酚（PCP）[3]。PCP化学性质稳定且不易降解，体内蓄积时会影响哺乳类动物的肝、肾和中枢神经等器官的正常生理活动[4]。若人们长期食用含PCP-Na或PCP的食品极易造成致癌、致畸和致突变等生理危害[5]。因此，中华人民共和国农业农村部公告第193号及第235号规定，所有动物源食品中禁止使用PCP及其钠盐[6-7]。2018年，国家食品药品监督管理总局对国家食品安全监督抽检中明确强调对畜禽产品及其副产品须严格检测PCP和PCP-Na[8]。郭文静等[9]抽检开封市9个市辖县区的蛋及蛋制品，发现PCP-Na的检出率为22.58%。动物源产品中PCP-Na或PCP的检测方法目前主要有气相色谱-串联质谱法[10-11]、高效液相色谱法（HPLC-MS/MS）[12]、高效液相色谱-串联质谱法[13]和超高效液相色谱-串联质谱[14-16]等。我国动物源性食品中主要依据GB 23200.92—2016规定检测PCP和PCP-Na药物残留量，但仅适用于动物肌肉、肝脏、肾脏、鱼肉、虾、蟹和牛奶等样品[17]。目前检测PCP-Na和PCP药物残留的方法主要涉及鸡肉组织、饲料以及水产品等[10-16]，而用于检测鸡蛋中PCP-Na药物残留的方法鲜有报道。本研究旨在建立一种高效、便捷、准确的HPLC-MS/MS检测鸡蛋样品中PCP-Na药物残留方法，以期为安全使用鸡蛋产品保驾护航。1材料与方法1.1材料与试剂标准物质：PCP-Na（纯度86.0%），购自Dr. Ehrensorfer GmbH公司；甲醇中的PCP标准溶液（0.998 g/L）购自中国兽医药品监察所。乙酸、甲酸和氨水为分析纯均购自国药集团。乙腈、甲醇为色谱纯，均购自Merck公司。水为超纯水。样品来源：鸡蛋样品随机购自当地超市。1.2仪器与设备岛津LC-MS 8050液相质谱联用仪（日本岛津公司）、CPA225D分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）、KQ3200型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）、TGL-16B冷冻高速离心机（上海菲恰尔分析仪器有限公司）、WX-80A旋涡混合器（北京六一仪器厂）、HH恒温水浴锅（湖北琴台医疗器械厂）、N-EVAPTM111氮吹仪（美国路易公司），60 mg/3 mL Agilent Bond Elut Plexa PAX固相萃取柱（Agilent公司），0.2 µm PTFE-Q 针头过滤器（Agilent公司）。1.3溶液配制5%氨水乙腈溶液：先量取100 mL的乙腈置于200 mL容量瓶中，再量取10 mL氨水缓慢加入混匀后用乙腈定容至200 mL。4%甲酸甲醇溶液：先量取50 mL的甲醇置于100 mL容量瓶中，再量取4 mL甲酸缓慢加入容量瓶，用甲醇定容至100 mL。2%甲酸甲醇-水溶液：量取50 mL 4%甲酸甲醇溶液置于100 mL容量瓶中，加水定容至100 mL。5%氨水溶液：量取100 mL的水置于200 mL容量瓶，再量取10 mL氨水缓慢加入混匀后用水定容至200 mL。8%甲酸甲醇溶液：先量取100 mL的水置于200 mL容量瓶中，再量取16 mL甲酸置于200 mL容量瓶中，用甲醇定容至200 mL。PCP储备液：用甲醇将PCP配成浓度为1 g/L的标准工作液，-20 ℃避光贮藏。1.4试验方法1.4.1检测样品的制备取适量的鸡蛋样品去壳混匀，作为空白试样。取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。样品-20 ℃以下贮存。称取（2.00±0.02） g空白样品于50 mL离心管中。分别用5 mL的乙腈、2%氨水-乙腈、5%氨水-乙腈和8%氨水-乙腈作为提取溶液进行试验。涡旋30 s，超声10 min，在4 ℃条件下10 000 r/min离心8 min，移取上清液于新的50 mL离心管中。离心后的残渣再重复提取一次，合并上清液。若上清液有浑浊则应再次离心。固相萃取柱的选择：以参考文献[14]中的研究方案比较C18、Oasis HLB、Oasis MAX和Agilent Bond Elut Plexa PAX固相萃取柱的回收率和净化效果。以使用Agilent Bond Elut Plexa PAX固相萃取柱为例。将Agilent Bond Elut Plexa PAX固相萃取柱固定在架子上，依次用3 mL甲醇和3 mL水淋洗进行活化；将上述提取液以小于1.0 mL/s的流速过柱后；依次用5 mL 5%氨水溶液、5 mL甲醇、5 mL 2%甲酸甲醇-水溶液进行淋洗后，弃去流出液，用真空泵抽干固相萃取柱2 min；以4 mL 8%甲酸甲醇溶液洗脱，抽干小柱；将洗脱液收集到干净具刻度的15 mL离心管中。为比较不同滤膜对PCP回收率的影响，将上述洗脱液过0.22 µm普通滤膜或Agilent PTFE-Q针头过滤器后供HPLC-MS/MS测定分析。1.4.2仪器条件液相色谱条件：色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18（1.8 µm，50 × 2.1 mm）或Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 × 50 mm，1.8 µm）；流动相：A相5 mmol/L乙酸铵溶液或2 mol/L乙酸铵溶液（含 0.1%的甲酸），B相甲醇；柱温为25 ℃；进样量为5.0 μL。梯度洗脱程序：0~7.0 min，40% B~100% B，7.0~7.5 min，100% B~40% B，7.5~12.0 min，40% B。质谱反应条件：电喷雾离子源模式（ESI-）；干燥气温度为300 ℃；干燥器流速为5.0 L/min；雾化器压力为310.26 kpa；鞘气温度为250 °C；鞘气流速为11.0 L/min；多反应检测方式（MRM）；毛细管电压为3 500 V（-）；喷嘴电压为500 V（-）；定量离子对为264.7/264.7；定性离子对为262.7/262.7和266.7/266.7；裂解电压为120 V；碰撞能量为5 eV。1.4.3标准曲线的制作准确量取适量的PCP标准工作溶液，用流动相稀释配置成浓度为20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/L的PCP标准工作液，检测时现配现用，每个浓度检测3次，采用1.4.2的色谱条件进行测定。2结果与分析2.1色谱柱的选择使用不同的色谱柱时，药物的保留时间可能有所不同。本研究分别对色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18和Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18进行了比较。结果发现，Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18对PCP的分离度更好，响应值更高。因此，本方法选Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱。2.2流动相的选择根据夏宝林等[15]研究发现，不同的流动相体系会影响样品分离的效果，结果检测时易出现杂峰和拖尾的现象。本研究比较了5 mmol/L乙酸铵溶液或2 mol/L乙酸铵溶液（含0.1%的甲酸）与甲醇组合的流动相体系。结果显示，5 mmol/L乙酸铵溶液与甲醇为流动相体系梯度洗脱时效果最佳，样品检测结果无拖尾和杂峰干扰现象。因此，本研究选用5 mmol/L乙酸铵溶液与甲醇作为流动相体系。2.3提取试剂的选择本试验分别比较了以乙腈、2%氨水-乙腈、5%氨水-乙腈和8%氨水-乙腈为提取液的提取效果。结果表明，5%氨水-乙腈的提取效果最好。2.4净化条件优化为减少对色谱仪器的损害和降低背景化合物的干扰，通常需要对目标分析物进行净化与浓缩，常使用固相萃取（SPE）净化方法对提取液进行净化和浓缩。因动物组织中含有大量蛋白质和脂肪物质，对药物测定产生很大干扰，因此净化步骤必不可少。本研究对C18、Oasis HLB、Oasis MAX和Agilent Bond Elut Plexa PAX固相萃取柱的回收率和净化效果对比显示，Agilent Bond Elut Plexa PAX固相萃取柱对PCP的回收率最高。Agilent Bond Elut Plexa PAX固相萃取柱适用于净化复杂的样品基质，其采用独特的新型羟基化外表面、疏水性内部结构和高级聚合物骨架，这种高级材料具有单分散粒径分布，流动特性出色，极少出现柱床堵塞的特点。因此，本研究选用Agilent Bond Elut Plexa PAX固相萃取柱进行后续试验探究。2.5滤膜的选择有研究表明，普通滤膜对PCP具有吸附作用，导致药物的回收率很低。但是，本研究发现使用Agilent PTFE-Q（亲水PTFE）针头过滤器的回收率较高，对PCP无吸附作用。这可能与Agilent PTFE-Q（亲水PTFE）针头过滤器同时兼容水相和有机溶剂，通过严格的质控保证，具有极低的溶出相关。2.6线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量限（见图1~图3）在最优的试验条件下，对一系列浓度的标准溶液进行提取测定。由图1可知，PCP-Na在0.5~20.0 μg/L范围内均具有良好的线性关系，线性方程为y=37 443.9x-15 166.5（R2 =0.999 075 1）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.005.F001图1PCP-Na的标准曲线Fig.1Standard curve of PCP-Na以试验得到特征离子色谱峰信噪比，以达到信噪比（S/N）≥3时样品的最低浓度为该方法的检出限（LOD），以达到S/N≥10时样品的最低浓度确定为方法的定量限（LOQ），该方法的实际检出限为0.5 µg/kg，定量限为1.0 µg/kg。基质中添加药物后和空白得到的特征离子质量色谱见图2、图3。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.005.F002图2鸡蛋中五氯酚的色谱图（1 μg/L）Fig.2Chromatogram of pentachlorophenol in eggs (1 μg/L)XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.005.F003图3空白鸡蛋样品色谱图Fig.3Chromatogram of blank egg sample2.7回收率和精密度（见表1）在空白样品中进行浓度为1、2、10 µg/L的加标回收试验。由表1可知，五氯酚的平均回收率在78.99%~81.92%，相对标准偏差（RSD）在0.18%~0.20%。结果表明该研究方法的回收率较高，重复性好。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.005.T001表1五氯酚在鸡蛋样品中的回收率Tab.1Recovery of pentachlorophenol in egg samples添加浓度（µg/L）回收率平均回收率RSD178.8079.9377.2782.7376.2078.990.20286.0784.4379.7079.7074.2780.830.181080.0279.3283.6284.4782.2081.920.19%3结论本研究建立了HPLC-MS/MS检测鸡蛋中PCP-Na残留的分析方法。鸡蛋样品中PCP-Na的平均回收率为78.99%~81.92%，检出限为0.5 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg，适用于鸡蛋中PCP-Na残留检测的要求。