冠状病毒属于单股正链RNA病毒，主要由4种结构蛋白组成，即刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N），可感染人类和多种动物[1]。犬冠状病毒（CCoV）与猪传染性胃肠炎病毒（TEGV）、猫冠状病毒（FCoV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）同属于冠状病毒科α病毒属[2]，可感染犬、狐狸和貉等动物[3]。CCoV与FCoV抗原相关[4]，已确认两种基因型：CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ。根据CCoV S蛋白N末端区域的氨基酸序列，CCoV-Ⅱ被进一步分为两种亚型：即CCoV-Ⅱa和CCoV-Ⅱb[5-6]。国内犬冠状病毒病的检出率较高，已成为影响宠物犬及实验犬集约化养殖的重要传染病之一，但目前仍缺乏特效治疗药物，准确的诊断与积极的预防是防控该病的重要措施[7]。本文通过对CCoV的流行病学、致病机制、临床症状、诊断方法及防治措施等方面进行总结，以期为犬冠状病毒病的防治及研究提供参考。1流行病学及致病机制1971年，科学家Binn从患急性肠炎的德国军犬中分离获得CCoV[8]，随后陆续有多个国家和地区报道了CCoV的感染情况，目前国内CCoV的阳性检测率已达到20%~40%[9]。He等[10]在2018年至2019年期间收集中国多个省份213只腹泻宠物犬的粪便样本，共检测到51份样本（23.94%）呈CCoV阳性，同时检测发现多只犬存在犬细小病毒（CPV）、犬星状病毒（CaAstV）、犬库布病毒（CaKoV）等多种病毒合并感染的现象。其检测结果还显示，多只阳性犬存在不同CCoV亚型的混合感染，与Wang等[11]对中国东北地区201份腹泻犬粪便样本检测研究结果相符，并且表明国内以CCoV-Ⅱ亚型流行为主[10-11]。目前，犬冠状病毒病已成为影响养犬行业发展的重要传染病之一。CCoV的感染率高，所有年龄的犬均可感染，感染后潜伏期为3 d左右，死亡率低。但多数研究表明，幼犬的感染率与死亡率明显高于成年犬[9,12]。此外，CCoV感染具有明显的季节性特点，在气温较低的春冬两季发病率更高[13]。犬感染CCoV 9 d后即开始散播病毒，并且散毒过程可能会维持数月[14-15]，患病犬及隐性带毒犬是CCoV的主要传染源。CCoV对于环境条件无特殊的耐受性，因此携带病毒的犬对于维持该病毒的存在很重要。CCoV可耐受胃的酸性环境[16]，通常在十二指肠部位发生感染。感染后蔓延迅速，涉及部分小肠，主要感染和损伤小肠绒毛成熟上皮细胞，导致小肠消化和吸收能力降低，引起犬腹泻，并随排便并不断向体外排毒[4]。一般在无并发症的情况下，患病犬很快康复。2临床症状CCoV感染后传播能力强，犬舍中若出现患病个体很快会波及全群。CCoV感染后主要损伤肠道，临床症状以犬不同程度的肠炎为主。不同年龄阶段的犬临床症状的表现可能不同，主要包括食欲减退、精神萎靡、呕吐和腹泻等症状，症状严重的犬会出现水样或黏稠腹泻，有些粪便中会混合血液或黏膜[16]。通常感染CCoV的幼犬临床症状比成年犬严重，幼犬感染后因呕吐腹泻迅速脱水，导致体重减轻和机体衰弱，症状严重的幼犬在感染后1~2 d内死亡。大多数成年犬在治疗后7~10 d内康复，但感染后的犬存在长期带毒的风险，导致该病反复发作[4]。此外，患病犬还可能因为继发细菌、寄生虫或其他病毒感染而延迟康复，严重者甚至感染致死。3诊断方法3.1临床诊断CCoV感染后主要侵袭损伤肠道，前期以腹泻、呕吐为主要症状，临床经验丰富的兽医从业人员可基于流行病学及患病动物的主要临床症状进行初步诊断。但CCoV感染与轮状病毒（CRV）感染临床症状相似，患病犬常以多种病毒混合感染的形式出现，不易得出确切诊断结果，临床常需配合使用商品化的快速检测试纸进行诊断[9]。3.2电镜观察CCoV粒子表面有大量纤突，形成特殊的“冠状”结构，可用电镜观察到其独有的形态。电镜下可能会在感染动物粪便中检测到病毒，但由于粪便中杂质较多，容易形成一定干扰，加之部分检测机构没有相应设备，均限制了该检测方法的临床应用[17]。3.3病毒分离培养病毒分离培养是病原检测公认的标准方法。CCoV可以通过犬肾细胞（MDCK）和猫肾细胞（CRFK）进行分离培养，接种不同代数的病毒后细胞还会出现不同程度的病变[18]。但这个过程耗时长、要求高，且不同毒株分离培养结果不同，CCoV-Ⅱ型毒株可在犬科和猫科等多个细胞系上生长，而CCoV-Ⅰ型毒株暂时未能从细胞培养物中有效分离[1,19]。采用病毒分离培养的方法可能会导致病毒的检出率降低，通常还需进行进一步鉴定，限制其作为临床诊断的检测方法。3.4血清学诊断血清学诊断是兽医临床常用的检测诊断方式之一，血清中和试验或间接免疫荧光试验均可用于检测血清抗体效价是否增加。其中血清中和试验具有较高的灵敏度，与阴性血清及其他病毒不发生交叉反应[20]。吕海峰[21]以CCoV M基因建立的胶体金检测试纸条特异性好，不与犬瘟热病毒（CDV）、CPV、犬腺病毒（CAV）产生交叉反应，其检测结果与进口检测试纸的符合率为100%，可检测到CCoV含量最低达到102.8TCID50/mL。胶体金免疫层析试纸能够快速准确检测CCoV，常应用于CCoV流行病学调查及临床诊断的过程[22]。3.5聚合酶链反应（PCR）检测PCR检测具有特异性强、灵敏度高的特点。以CCoV基因保守序列为模板设计PCR引物建立的多种PCR检测方法均可检出粪便样品中的CCoV。随着技术不断进步，目前CCoV PCR检测常用方式有普通PCR[23]、反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）[18,24]、实时荧光定量RT-PCR[25-26]和双重纳米PCR[27]等。3.5.1普通PCR和RT-PCR苏霞等[23]建立的CDV、CPV和CCoV的三重PCR检测方法的检测结果与单项PCR的检测结果一致，并且其敏感性高于普通PCR。国内早期由胡贵学等[24]以美国引进的CCoV NL-18毒株的反转录产物为模板初步建立了RT-PCR检测方法，成功扩增出目的条带并将其应用于国内CCoV毒株的检测。目前，应用RT-PCR检测方法检测CCoV的技术已经相对成熟，但PCR检测及RT-PCR检测过程中较容易产生交叉污染，检测结果容易产生误差，且对检测人员专业技术的要求较高。3.5.2实时荧光定量RT-PCR根据所用荧光化学物质不同，实时荧光定量RT-PCR可分为荧光染料法（以SYBR Green Ⅰ法为主）和荧光探针法（以TaqMan法为主）。侯凯文等[25]利用CCoV M基因的高度保守区域基因片段设计特异性的探针和引物，建立TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法重复性好，在扩增其他病毒基因时均为阴性，特异性强，并在病毒核酸含量较低的情况下也能够有效检测到该病毒。实时荧光定量RT-PCR（染料法）利用SYBR-Green Ⅰ为染料，通过荧光反应强度可对病毒核酸进行定量，也可有效进行病毒检测。王静等[26]通过荧光定量三步法和试剂盒的内参染料校正建立的CCoV SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法能够有效降低CCoV检测过程中的非特异性影响。上述两种检测方法的特异性和敏感性均优于普通RT-PCR，并且可对病毒进行定量检测，其中探针法检测的费用较高，不适用于规模化检测。染料法中使用的染料可以与任何双链DNA结合，使qPCR反应中具有非特异性扩增产物出现导致荧光值增加，若不对试验步骤进行优化，可能会影响定量结果的准确性。3.5.3纳米PCR纳米PCR具有更高的导热性，可更快达到目标温度，从而减少非特异性扩增，并且通过改进传热实现更高的灵敏度，是一种灵敏、有效且省时的技术。王静[27]在2020年建立纳米PCR方法检测和区分CCoV基因型，主要以CCoV M基因的保守序列设计引物，通过不断优化PCR程序取得了较好的检测效果。试验结果表明，纳米PCR测定的灵敏度比传统的RT-PCR高100倍，敏感性优于RT-PCR，在病毒拷贝量较低的病料中也可检出病毒，并可区分CCoV-Ⅰ和CCoV-Ⅱ型，是一种有效的检测方法。4防治措施4.1治疗4.1.1对症治疗目前尚无治疗犬冠状病毒病的特效药，主要是进行对症治疗，包括止吐、止泻、补液和抗病毒等治疗措施。CCoV感染后应立即注射高免血清进行抗病毒治疗。呕吐、腹泻等犬冠状病毒病的主要症状会导致动物机体脱水及电解质失衡，故止吐、止泻和补液是该病主要的治疗措施，可选择静脉混合注射兽用乳酸格林、奥美拉唑、维生素B6、能量剂（三磷酸腺苷、肌酐和高糖溶液）等[28]。呕吐、腹泻还容易造成钾离子缺失，在进行补液治疗的过程中需要及时补充钾离子，缓解可能存在的低钾血症。4.1.2控制继发感染CCoV感染后易继发感染细菌或其他病毒，混合感染将加重病情。发现动物感染CCoV后出现继发感染，需及时使用抗生素或相应高免血清进行抗菌、抗病毒治疗。4.1.3日常护理CCoV感染后，患病犬较虚弱，治疗期间还应该做好日常护理工作。前期若患病犬持续呕吐、腹泻，应采取禁水禁食措施[28]；恢复初期，当犬不再呕吐和腹泻的两天后，可饲喂对患病犬胃肠道具有保护功能的处方罐头或益生菌，切忌饲喂刺激性食物造成反复伤害[29]。患病期间还需避免洗澡及出门，加强保暖防寒措施[30]。4.2防控措施4.2.1加强日常饲养管理应秉承“防重于治”的理念降低CCoV感染的危害。首先应做好环境及器具的日常清理消毒工作，保持饲养场所内环境及饮食、饮水卫生。定期更换消毒液品类，避免病原形成耐药性，降低灭菌消毒效果。场所和器具可采用3%次氯酸钠或2%福尔马林进行有效的消毒。4.2.2隔离及无害化处理做好隔离及无害化处理措施可有效切断病毒传播。CCoV传播速度快，主要通过粪-口传播，易感犬间接或直接接触患病犬和带毒犬的粪便及被污染的水源均存在感染风险。犬舍中出现病例应立即采取隔离及治疗措施，尽量避免易感犬接触患病或携带犬及其排泄物。感染致死的动物进行无害化处理，并及时对犬舍进行全面消毒。4.2.3增强免疫接种疫苗及幼犬汲取足够的母乳提升自身免疫力也是预防CCoV感染的有效措施之一。母源抗体对幼犬具有一定的保护作用，幼犬体内的母源抗体主要通过汲取母乳获得。在母犬妊娠期间注射CCoV疫苗使母犬保持较高的抗体水平可有效保护幼犬，目前已有应用于妊娠母犬的灭活疫苗提高初乳中母源抗体的水平，但这些疫苗诱导的保护水平还不确定[31]。在幼犬适龄时期，及时接种疫苗也可降低CCoV的感染率。接种疫苗后可刺激肠道产生抗CCoV的抗体免疫球蛋白A（IgA），阻断CCoV侵袭肠上皮细胞，起到一定的免疫保护作用[32]。现针对CCoV的疫苗主要有辉瑞公司生产的八联苗和一些国产疫苗，有研究表明，CCoV的灭活苗及弱毒苗也具有一定的保护作用，目前这类疫苗的安全性虽有保障，但只能提供不完全的保护，接种疫苗后可减少但不能消除肠道中CCoV复制[1]。现有的多数疫苗针对经典的CCoV-Ⅱa型毒株感染而研制开发，因此这些疫苗不太可能保护CCoV-Ⅰ型毒株的感染，并且对变异的Ⅱ型毒株感染的保护也不确定[2]。虽然不同CCoV疫苗的保护效果仍存在争议，但CCoV流行病学调查发现，与接种疫苗的犬相比，未经疫苗免疫及免疫不全的犬CCoV感染发病概率更高。因此，按照免疫程序注射正规疫苗仍是保护犬免受CCoV感染的有效措施之一[33]。5结论CCoV属于单股正链RNA病毒，复制过程中变异率高，易出现毒力发生变化的新毒株。因CCoV具有极强的传染性，与单独饲养的犬相比，在犬养殖场和动物收容所等地CCoV血清阳性率明显更高。患病犬常呈CCoV多种基因型与多种病毒混合感染的情况，混合感染对幼犬常致命。鉴于国内CCoV的高检出率，未来仍需进一步深化对CCoV的研究和CCoV疫苗研制。日常可通过加强饲养管理、定期消毒检疫和注射商品化疫苗降低CCoV的传播概率和提升动物群抗病能力。