佐剂是用于增强免疫反应的疫苗成分[1]，传统铝盐佐剂的使用较为广泛[2]。目前研发多种新型免疫佐剂，鞭毛蛋白是新型免疫佐剂的候选者之一[3]。鞭毛蛋白是一种重要的病原体相关分子模式（PAMP），能够高效识别Toll样受体5（TLR5）和domain-containing protein 4（NLRC4），启动下游一系列信号通路、编码免疫介质相关基因的转录而发挥佐剂功能[4-6]。鞭毛蛋白在TLR5或NLRC4缺失的模型中也能够产生佐剂效应[7]。研究发现，鞭毛蛋白佐剂可以提高机体的免疫功能[8-9]。鞭毛蛋白是有效的疫苗佐剂和疫苗载体，但目前关于鞭毛蛋白发挥佐剂作用的分子机制尚不全面，且鞭毛蛋白可能会引发机体产生诸如炎症等不良反应[10]。因此，探索鞭毛蛋白发挥佐剂效应的作用机制对确保鞭毛蛋白佐剂的安全性和可靠性至关重要。本研究通过生物信息学的方法分析鞭毛蛋白刺激机体所引起的差异基因表达，从GEO数据库筛选出两个原始微阵列数据集GSE46421和GSE72016，进一步筛选出差异表达基因（DEGs）；对DEGs进行GO功能注释分析和KEGG通路富集分析，从而构建蛋白质互作网络（PPI）并筛选出关键基因（hub），为更好地理解鞭毛蛋白发挥佐剂功能的作用机制提供参考。1材料与方法1.1微阵列数据收集通过基因表达综合数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）获得来自GPL4134平台（Agilent-014868 Whole Mouse Genome Microarray 4x44K G4122F）的GSE46421和GSE72016微阵列数据集基因表达谱。GSE46421由5个C57BL/6J雌性小鼠经滴鼻免疫鞭毛蛋白4 h后采取血样样本和5个空白样本构成，GSE72016由5个C57BL/6J雌性小鼠经皮内免疫鞭毛蛋白4 h后采取皮肤样本和5个空白样本。来自GEO数据库的两个微阵列的基本信息见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.T001表1来自GEO数据库的两个微阵列的基本信息GSE号平台免疫方式采样位置样本数(试验/空白)GSE46421GPL4134intranasal（i.n.）blood5/5GSE72016GPL4134intraderma（i.p.）skin5/51.2数据统计与分析利用GEO2R工具（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/geo/geo2r/）分析鞭毛蛋白组和空白对照组之间的DEGs（校正后P0.05，|logFC|≥1）。通过维恩工具（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）分别获取GSE46421和GSE72016上调和下调DEGs的交集，用于后续分析。1.3GO和KEGG通路分析利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）分析DEGs所参与的GO和KEGG富集通路。其中GO分析包括：生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）。为了统计显著性，设定P0.05，错误发生率（FDR）1、基因数量≥5作为富集筛选条件。1.4PPI网络建设与核心基因筛选使用String（https://cn.string-db.org/）预测DEGs的PPI网络结构，由Cytoscape软件可视化PPI，并用Mcode插件分析具有高连通度的PPI子网络模块，利用CytoHubba插件按照MCC方法分析DGEs，确定PPI网络中排名前十的hub基因。2结果与分析2.1DEGs基因的识别结果（见图1、图2）由图1可知，GSE46421微阵列数据集中筛选出1 871个DEGs，包括776个上调基因和1 095个下调基因；从GSE72016微阵列数据集中筛选出3 014个DEGs，包括1 432个上调基因和1 582个下调基因。图1GSE46421和GSE72016微阵列数据集的火山图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.F1a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.F1a2由图2可知，两个数据集中上调基因有161个交集基因、下调基因中有121个交集基因。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.F002图2GSE46421和GSE72016数据集取交集的Venn图2.2GO功能富集和KEGG信号通路分析结果（见表2~表5、图3）通过DAVID对282个DEGs进行GO功能富集分析，得到78个差异显著的GO条目，BP条目53个、CC条目12个、MF条目13个。由表2、图3（a）可知，DEGs介导的BP生物学过程主要集中于信号转导、炎症反应、免疫反应、细胞因子和趋化因子的调节以及凋亡和能量代谢等过程。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.T002表2差异基因参与GO富集的生物过程（BP）条目描述基因数量P值错误发生率GO：0006954inflammatory response270.000.00GO：0002376immune system process260.000.00GO：0030593neutrophil chemotaxis110.000.00GO：0032740positive regulation of interleukin-17 production70.000.00GO：0050729positive regulation of inflammatory response100.000.00GO：0043547positive regulation of GTPase activity120.000.01GO：0070098chemokine-mediated signaling pathway70.000.01GO：0032755positive regulation of interleukin-6 production90.000.01GO：0006955immune response180.000.02GO：0045089positive regulation of innate immune response50.000.04GO：0002250adaptive immune response120.000.04GO：0019221cytokine-mediated signaling pathway90.000.05GO：0045087innate immune response200.000.08GO：0043123positive regulation of I-kappaB kinase/NF-kappaB signaling80.000.11GO：0019722calcium-mediated signaling60.010.19GO：0043410positive regulation of MAPK cascade80.010.26GO：1901224positive regulation of NIK/NF-kappaB signaling50.010.27GO：0032760positive regulation of tumor necrosis factor production130.000.00GO：0032720negative regulation of tumor necrosis factor production50.010.27GO：0006915apoptotic process160.020.36图3GO富集和KEGG信号通路气泡图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.F3a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.F3a2由表3、图3（b）可知，CC的分析结果主要集中于细胞外部、细胞膜、细胞质膜等位置。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.T003表3差异基因参与GO富集的细胞成分（CC）条目描述基因数量P值错误发生率GO：0005737cytoplasm1100.000.29GO：0016020membrane1060.000.09GO：0005634nucleus910.050.98GO：0005886plasma membrane880.020.79GO：0005576extracellular region360.010.29GO：0005615extracellular space340.030.87GO：0009986cell surface260.000.00GO：0009897external side of plasma membrane220.000.01GO：0043231intracellular membrane-bounded organelle220.060.98GO：0005730nucleolus170.071.00GO：0048471perinuclear region of cytoplasm160.071.00GO：0045121membrane raft100.020.65由表4、图3（c）可知，蛋白质结合、激酶激活、受体结合、细胞因子激活、膜信号转导等是重要的富集项目。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.T004表4差异基因参与GO富集的分子功能（MF）条目描述基因数量P值错误发生率GO：0005515protein binding880.010.36GO：0016787hydrolase activity290.061.00GO：0016491oxidoreductase activity150.030.96GO：0016301kinase activity150.051.00GO：0005102receptor binding140.000.33GO：0005125cytokine activity110.000.23GO：0004888transmembrane signaling receptor activity90.010.44GO：0005178integrin binding80.000.33GO：0008201heparin binding80.010.42GO：0046983protein dimerization activity70.030.96GO：0038023signaling receptor activity70.040.96GO：0005516calmodulin binding70.040.96由表5、图3（d）可知，DEGs主要参与细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、癌症通路等信号途径。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.T005表5差异基因参与KEGG信号通路条目描述基因数量P值错误发生率mmu04061Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor130.000.00mmu04064NF-kappa B signaling pathway130.000.00mmu04668TNF signaling pathway120.000.00mmu04060Cytokine-cytokine receptor interaction180.000.00mmu04062Chemokine signaling pathway130.000.00mmu04657IL-17 signaling pathway90.000.00mmu04620Toll-like receptor signaling pathway80.000.01mmu04630JAK-STAT signaling pathway100.000.01mmu04621NOD-like receptor signaling pathway110.000.01mmu04662B cell receptor signaling pathway50.030.17mmu05200Pathways in cancer140.050.25mmu04020Calcium signaling pathway80.060.29mmu04010MAPK signaling pathway90.060.30mmu04625C-type lectin receptor signaling pathway50.080.352.3PPI网络和hub基因分析结果（见图4~图7）由图4可知，鞭毛蛋白诱导机体的蛋白互作网络十分复杂，位于网络中心的大部分基因表达均为上调，主要有IL-6、MyD88、IL-10、CXCL2、CCL2、NFKBIA等；下调基因占少数，包括ADAMTS10、CD3G等。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.F004图4PPI网络图（1）使用Cytoscape可视化参与蛋白互作的网络，颜色越深、标签越大，蛋白互作越强。由图5可知，IL-6、MyD88、IL-10与多个蛋白存在互作关系，且相互作用最强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.F005图5PPI网络图（2）注：颜色越深、标签越大，蛋白互作越强。利用Cytoscape的插件Mcode筛选出两个高连通的PPI互作子模块。由图6可知，子模块A由MyD88、NFKBIA、CD80、CXCL2和ICAM1组成，子模块B由IL-6、IL-10、Lyn、Nod等基因组成。图6具有高连通度的PPI网络子模块10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.F6a1（a）子模块A10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.F6a2（b）子模块B使用CytoHubba插件筛选前十的hub基因，红色代表最高等级、黄色代表最低等级。由图7可知，hub基因的排序由高到低为IL-10、IL-6、CCL2、CXCL2、NFKBIA、MyD88、CCL7、ICAM1、JAK2、CCR5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.04.015.F007图7PPI网络中十个hub基因3讨论本研究中，对GSE46421和GSE72016微阵列数据集中鞭毛蛋白免疫组和空白对照组样本的DGEs进行GO分析，结果表明，鞭毛蛋白通过识别机体胞外TLR5和胞内NOD受体识别，主要通过活化MyD88、激活转录因子NF-κB，诱导机体产生免疫应答和炎症反应相关的多种细胞因子和趋化因子，促进机体启动先天性免疫和适应性免疫应答。鞭毛蛋白也可直接刺激机体B细胞、Th17细胞等免疫细胞的分化与成熟，促进机体分泌IL-17、IL-6等促炎因子，应对不良外在因素的挑战。鞭毛蛋白也会促发机体炎症应答、刺激产生肿瘤坏死因子（TFN）、IL-1等促炎因子。此外，鞭毛蛋白还参与细胞凋亡等生物途径。研究发现，鞭毛蛋白因其内在抗原性会导致炎症加剧的风险[11]。本研究发现，鞭毛蛋白会触发机体炎症反应，但是机体对鞭毛蛋白进行严格调控，使鞭毛蛋白能够清除病原体，避免过度的炎症加剧；GO分析结果表明，鞭毛蛋白可通过正向和负向调节炎症反应和TFN、IL-6等促炎因子产生；鞭毛蛋白还通过分泌IL-10、CXCL2等细胞因子调节免疫反应的强度。IL-10可同时发挥免疫抑制或免疫刺激的作用，是一种关键的抗炎介质[12]。IL-10通过下调单核细胞表面MHCⅡ的表达，降低MHCⅡ抗原呈递作用，下调T淋巴细胞活性，抑制炎性细胞的合成与释放、迁移和黏附维持机体免疫平衡[13-14]。而CXCL2作为白细胞迁移的重要调节物，主要功能是调节免疫/炎症细胞的迁移[15]。有研究发现，鞭毛蛋白还能够通过激活钙信号传导调节TLR对炎症刺激反应的性质和强度[6,16]。本试验中KEGG结果显示，鞭毛蛋白诱导机体产生的信号通路绝大部分均与免疫调节相关，如细胞因子信号通路、Toll样受体信号通路、Nod样受体信号通路、C型凝集素受体（CLR）信号通路等。细胞因子相关信号通过的功能是参与先天和适应性应答、炎症反应、宿主防御、细胞生长、分化、细胞死亡、血管生成以及旨在恢复体内平衡[17]。TLR是存在于巨噬细胞和树突细胞中的一类广受研究的受体，是抵御病原体入侵的第一道防线，在炎症、免疫细胞调控、存活和增殖方面发挥关键作用[18]。鞭毛蛋白通过激活TLR5，活化MyD88通路，释放NF-κB，诱导促炎性因子产生，激活先天性免疫和适应性免疫[19]。Nod样受体识别相应配体后能够激活NF-κB（Nod1和Nod2）信号途径，活化Caspase-1，促进促炎因子IL-1β和IL-18的产生，从而启动固有免疫和适应性免疫[20-21]。CLR在协调适应性免疫反应信号通路中也发挥重要作用[22]。本试验综合分析PPI和hub基因发现，鞭毛蛋白诱导机体表达的核心基因主要有IL-10、IL-6、MyD88和NFKBIA。IL-10用于防止机体对不良因素反应过度、维持机体免疫稳态[12]。IL-6在机体感染和组织损伤时迅速和短暂地产生，通过刺激急性期反应、造血和免疫反应促进宿主防御[23]。MyD88基因编码胞质衔接蛋白，其在先天性和适应性免疫应答中起关键作用[23]。NFKBIA是一个调节参与免疫、炎症和细胞存活的基因，主要用于调节细胞因子、黏附分子和其他免疫介质的分泌[24-25]。鞭毛蛋白能够通过活化MyD88分子激活核因子NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和干扰素（IFN）-调节因子（IRF）等信号通路，上调编码免疫相关基因的转录，促进TNF-α、IL-6等炎性细胞因子、趋化因子的分泌，进而促进局部和全身性免疫反应[20-21]。鞭毛蛋白还通过NF-κB介导的抗细胞凋亡特性诱导抗辐射反应[26]。4结论鞭毛蛋白通过识别细胞膜外TLR5和膜内NOD样受体，触发MyD88依赖性和MyD88非依赖性途径发出信号，激活转录因子NF-κB，这些信号促使机体产生级联反应，激发机体多类免疫相关介质的转录，产生IL-6、IL-10、TNF、CCL2等细胞因子和趋化因子，启动先天性免疫、适应性免疫以及炎症反应维持机体免疫稳态、发挥佐剂功能。