我国是蛋白质原料需求大国，豆粕中粗蛋白含量占40%~45%，是养殖业使用最广泛的饲料原料之一[1]。但豆粕蛋白中存在大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子（KTI）等多种抗营养因子，影响了动物对豆粕中营养物质的吸收利用，从而对动物的健康造成影响[2-4]。微生物发酵对豆粕进行处理能够降低豆粕中的抗营养因子，将豆粕蛋白分解成小肽和游离氨基酸，发酵过程中有益微生物及其代谢产物可以促进动物肠道健康[5]。甘露聚糖是自然界中半纤维素的第二大组分[6]，是一类含有以甘露糖残基之间的β-1,4键或甘露糖与葡萄糖或半乳糖之间的β-1,4键连接基本骨架的杂多糖。这些杂多糖属于抗营养因子，会影响营养物质的消化吸收[7-8]。β-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannanase）可以随机破坏β-1,4-甘露糖键，将其转化为甘露寡糖（MOS），在甘露聚糖分解中起到重要作用[9]。研究发现，β-甘露聚糖酶分解葡甘露聚糖或半乳甘露聚糖产生的MOS，可促进动物肠道有益微生物生长[10]，具有治疗肠道疾病的作用[11-12]。豆粕中除了大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、KTI等之外，还含有大量的半乳甘露聚糖。关于微生物发酵降低豆粕中各类抗营养因子的报道较多[13-15]，但发酵过程中实时监测蛋白抗营养因子降解效果的报道较少。本试验以实验室保存的一株产β-甘露聚糖酶芽孢杆菌HTGC-10为菌种发酵豆粕，实时检测分析其对豆粕蛋白抗营养因子及甘露聚糖的降解作用效果，以期为更好地利用豆粕资源提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌株试验菌株为从南阳西峡县后塘沟村魔芋生产基地土壤中筛选的β-甘露聚糖酶高产菌株HTGC-10[16]。1.1.2主要原料和试剂豆粕购自东海粮油（张家港）工业有限公司，胰蛋白胨、酵母膏、琼脂粉、魔芋粉购自索莱宝生物科技有限公司，甘露糖购自麦克林生物技术有限公司，甘露聚糖购自Sigma公司，4%~20% SDS-PAGE预制胶购自南京艾思易生物科技有限公司，大豆球蛋白ELISA试剂盒、β伴大豆球蛋白ELISA试剂盒、大豆胰蛋白酶抑制因子（KTI）ELISA试剂盒购自天津龙科方舟生物工程技术有限公司，植物组织总蛋白提取试剂盒购自安诺伦（北京）生物科技有限公司。1.1.3培养基发酵培养基：魔芋粉15 g、蛋白胨8 g、酵母膏4 g、K2HPO4 1 g、MgSO4 0.25 g、蒸馏水1 000 mL，pH值7.0~7.2。种子培养基（LB液体培养基）：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1 000 mL，pH值6.8~7.2。1.2测定指标及方法1.2.1薄层层析将斜面上的HTGC-10菌株接入LB液体培养基中，37 ℃、150 r/min摇床过夜培养，按3%的接种量转接至发酵培养基（50 mL/250 mL瓶）中，30 ℃、180 r/min摇床发酵，在发酵不同时间（0、2、4、6、8、10、12 h）取样，沸水浴5 min、8 000 r/min离心10 min。参考文献[17]中的薄层层析法略有修改，分别取1 µL上清液，点样至G型硅胶板（100 mm × 100 mm）上，样品中低聚糖含量较低，因此每个样品需点样5次，双蒸水配制10 g/L甘露聚糖和甘露寡糖（甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖），分别点样1 µL。展层剂：正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶1；展层约5 h，显色剂∶硫酸∶甲醇=1∶4，喷洒后置于110 ℃烘干15 min。1.2.2菌株HTGC-10的生长情况及对豆粕蛋白的降解能力分析称取100 g豆粕，加入1 000 mL蒸馏水，匀浆机匀浆，制成10%豆粕匀浆，后按5%接种量接入HTGC-10种子液，30 ℃、180 r/min摇床发酵，在发酵不同时间（0、3、6、9、12、24、36、48 h）取样，分成3份，一份直接梯度稀释，涂LB平板，测定活菌数，并观察杂菌污染情况；一份-20 ℃保存，用于测定抗营养因子；另一份冷冻干燥，使用蛋白提取试剂盒提取蛋白，进行SDS-PAGE电泳（4%~20%预制胶）。1.2.3HTGC-10菌株对大豆抗营养因子的降解作用分析按照试剂盒说明，将不同时间取样、-20 ℃保存的样品分别使用大豆球蛋白ELISA试剂盒、β伴大豆球蛋白ELISA试剂盒及KTI ELISA试剂盒，测定样品中残留的各抗营养因子的含量，分析HTGC-10菌株对大豆抗营养因子的降解作用效果。2结果与分析2.1HTGC-10菌株发酵不同时间薄层层析结果（见图1）由图1可知，发酵培养基中的糖成分比较复杂，在发酵2 h，发酵培养基出现了甘露二糖，且甘露三糖和甘露四糖的浓度也有所增加，在发酵4、6 h，甘露二糖、甘露三糖和甘露四糖的含量逐渐增加；但随着发酵的继续（至发酵8 h后），甘露寡糖（甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖）含量逐渐降低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.017.F001图1HTGC-10菌株发酵不同时间薄层层析结果注：0为甘露聚糖标准品；M为甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露戊糖制成的Marker对照；1~7分别为发酵0、2、4、6、8、10、12 h样品。2.2不同发酵时间对豆粕接种HTGC-10菌株生长的影响（见表1）由表1可知，10%豆粕接种菌株HTGC-10后，发酵初期接入的菌株占绝对优势，在发酵6 h后开始滋生杂菌；到发酵12 h杂菌的数量已经与HTGC-10菌株相近，在随后的发酵过程中，杂菌滋生非常快；至发酵24 h，杂菌数量是接入的芽孢菌的2~3倍；继续发酵至48 h，基本没有芽孢菌。综上，在自然粗放的豆粕发酵过程中，因为杂菌滋生严重，发酵时间不宜过长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.017.T001表1不同发酵时间对豆粕接种HTGC-10菌株生长的影响发酵时间/h活菌数/(个/mL)活菌特征描述04.00×107为接种的活菌数，均是HTGC-10菌株35.70×107为HTGC-10菌株，基本无杂菌67.00×107大多为HTGC-10菌株，杂菌已开始出现91.30×108多数为HTGC-10菌株，有部分杂菌存在122.90×109HTGC-10菌株和杂菌数相差不多248.20×109杂菌数量是HTGC-10菌株的2~3倍361.37×1010杂菌数量是HTGC-10菌株的约10倍483.09×1010基本均是杂菌，偶尔有几个HTGC-10菌株2.3菌株HTGC-10不同发酵时间对未灭菌豆粕的降解电泳结果（见图2）由图2可知，发酵初期（发酵前3 h），分子量在20~40 kDa的蛋白含量明显下降，而小分子蛋白（分子量小于20 kDa的蛋白）明显增加；随着发酵进行（发酵3~24 h），分子量在20 kDa以上的蛋白逐渐被降解；但随着发酵时间延长（24~48 h），菌株对大分子量蛋白的降解作用消失，甚至出现了一些新的分子量较大的蛋白。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.017.F002图2菌株HTGC-10不同发酵时间对未灭菌豆粕的降解电泳结果注：M为蛋白Marker；1为未灭菌豆粕样品；2~8分别为灭菌匀浆接种HTGC-10发酵3、6、9、12、24、36、48 h样品。2.4HTGC-10菌株对大豆抗营养因子的降解作用（见表2）由表2可知，菌株HTGC-10对大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和KTI的降解作用，主要发生在发酵0~24 h。在发酵24 h，大豆球蛋白降解至原含量的11.9%，β-伴大豆球蛋白解至原含量的18.5%，KTI解至原含量的2.0%；发酵24~48 h对大豆抗营养因子的降解作用较小，大豆球蛋白含量降解至原含量的5.6%，β-伴大豆球蛋白含量降解至原含量的14.2%，KTI降解至原含量的1.1%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.017.T002表2HTGC-10对未灭菌豆粕中抗营养因子的降解作用发酵时间/h大豆球蛋白β-伴大豆球蛋白KTI0143.12164.557.083147.53154.795.026109.86140.572.639102.1478.960.651224.4753.310.132417.0130.520.14367.9525.050.12488.0123.30.08mg/g2.5HTGC-10发酵豆粕前后主要营养成分比较（见表3）由表3可知，菌株HTGC-10发酵豆粕24 h后，氨基酸总量比发酵前增加13.9%，酸溶蛋白、总游离氨基酸、小分子肽、还原糖含量分别增加至发酵前的11倍、9.91倍、11.35倍和2.2倍，尿素酶活性下降至发酵前20%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.017.T003表3HTGC-10发酵豆粕前后主要营养成分比较组别氨基酸总量/%酸溶蛋白/%总游离氨基酸/%小分子肽/%还原糖/(g/100 g)尿素酶活性/(U/g)发酵前豆粕41.261.890.451.441.00.15发酵后豆粕46.9820.814.4616.352.20.033讨论3.1菌株HTGC-10发酵甘露聚糖薄层层析分析菌株HTGC-10发酵甘露聚糖初期（0~6 h），甘露二糖、甘露三糖和甘露四糖含量逐渐增加，表明在甘露聚糖酶的作用下，甘露聚糖不断分解，产生了小分子的甘露寡糖（MOS），与Kulcinskaya等[18]报道的芽孢杆菌降解瓜儿豆胶及Srivastava等[10]发现的米黑根毛霉的甘露聚糖酶降解甘露聚糖和魔芋的研究结果相似；随着发酵继续（至发酵8 h），甘露寡糖（甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖）含量逐渐降低，原因可能是随着菌体大量生长，小分子糖作为碳源被消耗。3.2菌株HTGC-10对豆粕蛋白的降解能力分析菌株HTGC-10发酵10%豆粕匀浆，发酵初期（发酵0~3 h），20~40 kDa间的蛋白先被降解成分子量小于20 kDa的蛋白；随着发酵进行（发酵3~24 h），分子量在20 kDa以上的蛋白逐渐被降解，即在发酵前24 h，豆粕蛋白降解效果显著，比刘爱华等[19]报道的枯草芽孢杆菌降解菜籽粕蛋白的效果显著；但继续发酵，菌株对大分子量蛋白的降解作用消失，甚至出现了一些新的分子量较大的蛋白。结合菌株生长情况，该结果可能与豆粕未做灭菌处理、杂菌滋生严重有关，因此，未做灭菌处理的豆粕发酵，时间不宜太长，最好不要超过24 h。3.3HTGC-10菌株对大豆抗营养因子的降解作用分析菌株HTGC-10对大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和KTI的降解作用，主要发生在发酵24 h内。在发酵24 h，大豆球蛋白剩余11.9%，β-伴大豆球蛋白剩余18.5%，KTI仅剩2.0%，比李莹等[20]在不同企业采集的绝大多数发酵豆粕及周天骄等[21]从全国各地采集的大多数发酵豆粕中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和KTI的含量低得多，表明用菌株HTGC-10发酵豆粕，降解其中的抗营养因子具有切实可行性；发酵24~48 h对豆粕抗营养因子的降解作用较小，与电泳结果基本一致，进一步表明了豆粕发酵时间不需要太长（24 h内）。3.4HTGC-10发酵豆粕前后主要营养成分比较分析HTGC-10发酵豆粕24 h后，小分子肽含量大量增加，至发酵前的11.35倍，这与电泳图结果发酵过程中大分子量蛋白被逐渐降解成小分子肽的结果一致；发酵后还原糖增加至发酵前的2.2倍，结合薄层层析结果，表明HTGC-10发酵豆粕过程中，将纤维素、半纤维素等多糖降类解成了小分子寡糖，还原糖含量没有像小分子肽增加得那么多，可能与发酵过程中随着菌体的大量生长，小分子糖作为碳源被消耗掉有关。4结论试验采用从南阳西峡县后塘沟村魔芋生产基地土壤中筛选的β-甘露聚糖酶高产菌株HTGC-10为发酵菌株，通过其发酵降解甘露聚糖，发现该菌株可以将甘露聚糖降解为小分子的MOS；使用菌株HTGC-10发酵10%豆粕，电泳结果显示，在发酵0~24 h，菌株HTGC-10对豆粕大分子蛋白具有很好的降解作用，但随着发酵时间延长，菌株对蛋白的降解作用不明显；发酵24 h内，菌株HTGC-10具有很好的降解抗营养因子效果，可将豆粕中的大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和KTI等抗营养因子分别降解至原含量的11.9%、18.5%和2.0%，继续发酵（24~48 h）对豆粕抗营养因子的降解速度下降，可能与未灭菌豆粕发酵后期杂菌的滋生严重有关。因此，实际操作过程中豆粕发酵时间24 h为宜。