肉鸡产业是我国主要畜禽产业之一，2021年全国肉鸡总出栏量比2020年增加了7.4％[1]。肉鸡产量增加的同时也要严格要求肉品质。肉鸡在被屠宰后体内的抗氧化能力降低，因此抗氧化酶无法快速清除有氧代谢产生的自由基，活性氧（ROS）自由基不断累积并攻击细胞，导致机体脂质氧化程度加深，肉品质下降[2-3]。脂质氧化的增强可促进蛋白质氧化，破坏蛋白质结构导致肉品质下降，如变色、变味和营养价值损失等，影响禽肉的货架期和经济效益[4-5]。生产中可通过添加抗氧化剂，如维生素E、益生菌和天然植物提取物等提高肉鸡抗氧化能力和肉品质[6-8]。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）-核因子E2相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）信号通路是肉鸡体内经典的抗氧化调节通路，在氧化应激条件下可以调节相关抗氧化蛋白的表达，对抵御外界的损伤和自身抗氧化防御具有重要意义[9]。本课题组前期研究表明，屠宰前适宜的电流和气体致晕方法可以调节Keap1/Nrf2-ARE通路，发挥延长鸡肉货架期的作用[2,10]。肉鸡屠宰后，基因和蛋白会快速降解。研究表明，添加抗氧化剂可以调节Keap1/Nrf2-ARE信号通路的表达，从而提高动物的抗氧化能力[11]。但目前，关于Keap1/Nrf2-ARE通路在屠宰后的潜在作用时间及添加抗氧化剂对屠宰后的作用时间未见报道。因此，本试验研究4 ℃储藏温度下，肉鸡屠宰后脂质氧化状态和Keap1/Nrf2-ARE信号通路关键分蛋白的变化规律，探索Keap1/Nrf2-ARE信号通路在屠宰后的潜在作用时间，为屠宰前通过营养调控技术改善肉鸡肉品质、延长货架期提供参考。1材料与方法1.1试验设计随机选取42日龄的健康AA肉鸡6只，每只鸡为1个重复，颈动静脉放血致死。每只鸡取同一块腿肌样品随机分为5个处理，分别对应5个储存时间，即0、1、2、4、7 d。0 d组取样后立即-20 ℃冻存；其余4组于4 ℃条件下分别储藏1、2、4、7 d，每组3份，其中1份于-20 ℃冻存，以检测氧化和抗氧化的相关含量；此外两份于-80 ℃冻存，用以检测Keap1/Nrf2-ARE信号通路中相关蛋白和抗氧化酶活性。1.2试验材料考马斯亮蓝、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽硫基转移酶（GST）、总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液（强）（P0013B）、PMSF抑制蛋白酶（ST506）均购自上海碧云天生物有限责任公司。1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（DPPH）购自东京化成工业株式会社。1.3测定指标及方法1.3.1氧化与抗氧化酶准确称量1.00 g肉鸡样品（-20 ℃）置于10 mL离心管中，加入4 mL生理盐水，低温（4 ℃）使用多样品快速匀浆机（Tiss-96，上海净信实业发展有限公司），得到20％匀浆液，2 500 r/min（4 ℃）离心20 min，取上清液-20 ℃保存。MDA、H2O2、GSH-Px、GST、T-AOC及总蛋白含量检测方法参考试剂盒说明书。1.3.2DPPH自由基清除能力DPPH自由基清除能力的测定参照张欣等[2]的方法稍作修改，肌肉匀浆稀释至10％后与0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液按照1∶3混匀，避光室温反应30 min，低温（4 ℃）3 500 r/min离心10 min，取上清液于517 nm处测定吸光度值（A样品）。使用不同质量浓度的Trolox溶液与DPPH乙醇溶液按照1∶3混匀，制作标准曲线，横坐标为不同质量浓度的Trolox溶液，纵坐标为吸光度值，得到标准曲线为y=-2.768x+0.612 5，R2=0.990 2，计算DPPH自由基清除能力。肌肉匀浆液清除DPPH能力=(A样品吸光度-b)/(a×样品蛋白含量)(1)式中：b为标准曲线中x的系数，b=-2.768；a为标准曲线中常数项，a=0.612 5。1.3.3Keap1/Nrf2-ARE信号通路相关蛋白表达量检测取-80 ℃保存的肉鸡腿肌样品40 mg快速充分剪碎，放入2 mL离心管中，加入400 μL含PMSF的RIPA裂解液，冰上匀浆后4 ℃、2 500 r/min离心20 min，使用移液枪将匀浆上清液分装成2份。根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，检测总蛋白浓度，采用鸡Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）ELISA检测试剂盒、鸡核因子E2相关因子（Nrf2 ELISA检测试剂盒、鸡血红素氧合酶1（HO-1）ELISA检测试剂盒和鸡谷胱甘肽硫基转移酶（GST）ELISA检测试剂盒测定肉鸡腿肌中Keap1、Nrf2、OH-1和GST蛋白含量，ELISA蛋白检测试剂盒均购自武汉默瑞斯生物科技有限公司，检测方法参考说明书。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2010软件进行整理，SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值和标准误”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1不同储藏时间对肉鸡腿肌脂质氧化产物、抗氧化能力和酶活性的影响2.1.1不同储藏时间对肉鸡腿肌脂质氧化产物的影响（见表1）由表1可知，在4 ℃的储藏条件下，屠宰后0 d，肉鸡腿肌中MDA含量显著低于1、2、4、7 d（P0.05）。宰后4 d，肉鸡腿肌中H2O2含量显著高于0、2 d（P0.05）。在4 ℃储藏条件下，屠宰后肉鸡腿肌中H2O2含量与储藏时间具有一次线性关系（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.013.T001表1不同储藏时间对肉鸡腿肌的脂质氧化状态的影响项目MDA/(μmol/g prot)H2O2/(mmol/g prot)0 d0.46a1.57a1 d1.09b2.29ab2 d0.90b2.09a4 d0.82b3.41b7 d0.84b2.61ab标准误0.060.20P值组间0.0040.036线性0.1370.016注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.1.2不同储藏时间变化对肉鸡腿肌抗氧化能力和酶活性的影响（见表2）由表2可知，宰后1 d肉鸡腿肌中GSH-Px活性最高，显著高于宰后0、2 d（P0.05）。在4 ℃储藏条件下，宰后肉鸡腿肌中DPPH清除能力与储藏时间具有一次线性关系（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.013.T002表2不同储藏时间对肉鸡腿肌的抗氧化能力和酶活性的影响项目DPPH自由基清除能力/(μmol TE/g prot)T-AOC/(mmol/g prot)GSH-Px/(mmol/g prot)GST/(U/mg prot)0 d0.290.178.88a9.771 d0.290.1818.82b13.352 d0.270.178.33a11.534 d0.260.1715.49ab13.097 d0.250.1514.84ab9.75标准误0.010.011.230.64P值组间0.1700.4330.0170.211线性0.0190.1370.2590.9482.2不同储藏时间对肉鸡腿肌Nrf2/ARE信号通路相关蛋白的影响（见表3）由表3可知，在4 ℃条件下，屠宰后各时间段腿肌中Keap1、Nrf2、HO-1和GST的表达量差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.013.T003表3不同储藏时间对肉鸡腿肌Nrf2/ARE信号通路相关蛋白的影响项目Keap1/(ng/L)Nrf2/(ng/L)HO-1/(μg/L)GST/(μg/L)0 d635.302 143.1258.58126.151 d634.542 395.9956.86125.652 d700.472 580.5962.96144.894 d756.692 476.2765.53138.027 d755.302 351.8866.48127.90标准误44.19146.082.3010.81P值组间0.8470.9240.6360.978线性0.2800.6530.1540.8473讨论3.1肉鸡屠宰后储藏时间对腿肌脂质氧化产物、抗氧化能力和酶活性的影响正常生理活动中，少量ROS可参与机体的免疫过程，但当抗氧化系统被破坏后，多不饱和脂肪酸（PUFA）与过量的ROS反应产生的氧化产物可造成细胞损伤[12-13]。一些氧化产物，如MDA可以间接反映机体脂质氧化程度[12-15]。·OH、H2O2、·O2-等活性氧可作用于蛋白质，使氨基酸残基发生氧化，导致蛋白质构象改变而变性，甚至丧失蛋白质功能[15-16]。本试验表明，在4 ℃储藏条件下，宰后1~7 d，肉鸡腿肌中MDA和H2O2含量均高于0 d。张欣等[2]发现，屠宰后4、7 d肉鹅肝脏中MDA含量显著高于0 d。本试验发现，屠宰1 d肉鸡腿肌MDA含量显著高于0 d，而后略有下降，而H2O2含量在宰后4 d达到最高，表明宰后4 d细胞损伤程度最大，脂质氧化程度最高。T-AOC与DPPH自由基清除能力是评价体外抗氧化活性的重要指标[17-18]。GSH-Px和GST作为解毒酶同样可以降低氧化应激，其活性程度可以反映机体的抗氧化水平[19]。本试验结果表明，宰后1~7 d肉鸡肌肉中T-AOC与DPPH自由基清除能力虽无显著变化，但4 ℃时DPPH自由基清除能力与T-AOC呈下降趋势，故随着时间延长，抗氧化能力减弱。Xu等[10]研究发现，高电流、低频率电击可在宰后初期抑制脂质氧化，降低硫代巴比妥酸反应物（TBARS）水平，GST活性在初期较低；而当储藏时间增加，GST活性提高，保护肌肉免于脂质过氧化。本试验中，宰后1、4、7 d的肌肉中GSH-Px活性显著增加，此趋势与MDA和H2O2相似，表明宰后短期内脂质氧化产物增加可刺激抗氧化酶活性提高，与张欣等[2]研究鹅肝MDA含量增加抗氧化能力随之提高的结论相似。但宰后肌肉的抗氧化能力维持时间有限，随时间延长抗氧化能力逐渐减弱，脂质氧化产物不断积累，肌肉的脂质氧化程度升高。根据研究推断，肉鸡宰后储藏0~2 d有利于保持肉品质，为最佳货架期。动物被屠宰前添加抗氧化剂可提高肉品质，在屠宰后添加抗氧化剂则可达到肉保鲜的效果。为了保障食品健康，多添加壳聚糖、茶多酚和葡萄籽提取物等抗氧化剂保鲜[20-21]。研究表明，在添加此类具有抗氧化效果的保鲜剂后，肉的货架期延长，保鲜效果好[22-23]。但在实际生产中，动物在屠宰后添加保鲜剂较为困难，剥离肌肉后添加保鲜剂效果最佳的时限鲜少报道。本研究中，肉鸡肌肉脂质氧化状态在1 d内可维持较高水平，因此推测应在1 d内添加保鲜剂。3.2肉鸡屠宰后储藏时间对腿肌Keap1/Nrf2-ARE信号通路相关蛋白表达量的影响受到不利刺激后，原本处于非活状态的Nrf2与Keap1结合体解偶联，Nrf2入核调控相关蛋白表达，帮助机体抵御氧化应激[24-26]。还有一些下游靶蛋白也受到Keap1/Nrf2-ARE信号通路的诱导，如二相酶、抗氧化蛋白酶、抗炎因子、蛋白酶体/分子伴侣，抗氧化反应元件ARE可调控这些蛋白与体内氧自由基结合，将其代谢产生无害物质[27-28]。GST是常见的二项酶，而HO-1是常见的抗氧化蛋白酶[29]。胥蕾等[30]研究发现，电刺激频率320 Hz组的成肌细胞中Nrf2的mRNA相对表达量与其余试验组相比显著升高，而相同条件下H2O2含量正好相反，推测Keap1/Nrf2-ARE信号通路的激活降低了H2O2含量，但过高的H2O2会抑制Keap1/Nrf2-ARE信号通路的应答。本试验发现，宰后肉鸡肌肉中Keap1/Nrf2-ARE信号通路中Keap1、Nrf2、HO-1和GST的蛋白表达量均无明显变化，与0 d相比，第2、4、7 d时肉鸡肌肉Keap1、Nrf2、HO-1和GST的蛋白表达量均有所升高，蛋白表达有效性持续至第7 d。研究发现，在大鼠体内，某些基因控制的mRNA和蛋白质在动物死亡后的降解具有一定的时序性，不同脏器中肌动蛋白随死亡时间延长不断降解，心肌和肺脏中的微管蛋白（Tubulin）含量在死后1 d开始下降，于7 d时仍可检测出少许含量[31]。任广睦等[32]研究发现，大鼠死后GAPDH mRNA和β-actin mRNA的表达在心、脑和肺等脏器的表达均具有时效性，最长为5 d。因此，动物体内不同脏器中各指标蛋白及mRNA表达量不同。本试验仅采用ELISA检测方法检测了肉鸡腿肌的蛋白表达量，其检测片段小于蛋白总长度，无法完全反映蛋白降解情况和功能变化。本试验中抗氧化酶的活性1~7 d并未显著下降，与0 d相比仍处于相同的活性状态，表明Keap1/Nrf2-ARE信号通路还保留部分功能，但实际有效作用时间可能低于7 d，蛋白的结构和功能密切相关，降解过程中结构发生的微观变化有待进一步研究。未来可进一步采用蛋白免疫印迹和real-time PCR等多种检测方法研究肉鸡其他组织器官中Keap1/Nrf2-ARE信号通路相关蛋白和mRNA的变化规律。研究表明，一些抗氧化剂可以通过调控Keap1/Nrf2-ARE信号通路，提高动物抗氧化性能，减轻氧化损伤。肉鸡日粮中添加白藜芦醇可提高脾脏中抗氧化酶活性和Nrf2基因表达水平[33]。维生素E可以通过Keap1/Nrf2-ARE信号通路调控肉鸡成肌细胞的抗氧化能力[34]。因此，抗氧化剂对Keap1/Nrf2-ARE信号通路的表达具有积极作用，未来可添加抗氧化剂，以Keap1/Nrf2-ARE信号通路为靶点，延长肉鸡被屠宰后肌肉的储藏时间。4结论本试验中，在4 ℃的储藏条件下，Keap1/Nrf2-ARE信号通路相关调控蛋白的潜在作用时间可达7 d，抗氧化能力的潜在作用时间为7 d并在宰后1 d最强，随后抗氧化能力下降。