马鹿是仅次于驼鹿的大型鹿科动物，全世界共22个亚种，我国拥有天山马鹿、塔里木马鹿、阿尔泰马鹿等8个亚种[1]。2002年，清原马鹿在国家畜禽品种审定委员会审定下成为我国唯一人工培育的马鹿品种[2]，并被引种到吉林、黑龙江、内蒙古等多地[3]。人工输精技术是动物生产繁殖领域普及最广泛的技术手段，与自然交配相比可更准确、快速地传播遗传信息[4-5]。人工授精技术在梅花鹿繁殖中的应用日趋完善[6]，1960年我国首次完成了马鹿的人工授精[7]；1977—1981年试验并采用了公鹿试情法及母鹿半麻醉保定输精法，受胎率从22%提高到53.4%[8]。目前，通过人工授精的马鹿受胎率可达80%以上[9]。近年来国内外对清原马鹿繁育技术研究相对较少，特别是清原马鹿人工输精方面缺乏基础理论和操作技术的研究。马鹿体形硕大，通常采用麻醉保定方式完成人工授精，通过同期发情进行人工授精的母鹿甚至要经历多次麻醉保定[1]，麻醉和麻醉前后的应激反应不仅给动物自身带来很大风险，还会影响受胎率。此外，发情鉴定、输精次数、输精剂量等也是制约受胎率的因素。本试验研发清原马鹿“半支剂量”的冻精方法，探究输精次数、剂量以及保定方式对受胎率的影响，有效提高冻精利用率、确保较高受胎率、减少因麻醉保定引起的应激反应，降低人工授精时带来的母鹿功能损伤和经济成本损耗，为清原马鹿及其他品种鹿的人工输精方面的研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物供试为人工驯化状态良好、体态健康无疾病且性情、繁殖性能和遗传性能稳定的马鹿母本，分别来自令辉鹿场、长峰鹿场、杜成鹿场、永范鹿场、青林鹿场、胜全鹿场、城郊鹿场、清林家庭农场、荣海鹿场，共计172头；试验采精公鹿1头（海荣鹿场）、试情公鹿5头（分别来自清林家庭农场、城郊鹿场、海荣鹿场、杜成鹿场、长峰鹿场）。1.1.2精液试验所用精液采自抚顺市清原满族自治县清林家庭农场的同一只种公鹿，其种公鹿产茸量为24.3 kg/年，身体健康无疾病，繁殖性能和遗传性能稳定。1.1.3试剂Trilady稀释液（Minitube公司），鹿眠宝3号、鹿醒宝3号（吉林省华牧动物保健有限公司），孕马血清促性腺激素注射液（PMSG，1 000 IU/支，杭州动物药品厂），绵羊用孕酮阴道栓（CIDR，孕酮含量100 mg，哈密尔顿生物公司），促黄体素释放激素A3（宁波三生生物科技有限公司），盐酸右美托咪定（10 mL/5 mg，硕腾动物保健公司）。1.2试验方法1.2.1冻精制备采集种公鹿新鲜精液，要求：色泽正常，无尿液污染，有效精子数量≥6亿个/mL，精子活力≥0.65，精子畸形率≤0.15，方可进行冻精制备。冻精解冻后有效精子数量≥0.32亿个/mL，精子活力≥0.4，方可用于人工授精。鲜精采集后采用Trilady稀释液进行稀释，装入细管中，规格分别为0.250 mL/支（1支装）和0.125 mL/支（半支装），细管在4 ℃下降温，平衡6 h，再使用液氮进行冷冻[10]，共制备冻精细管200支（半支装和1支装各100支）。1.2.2不同剂量制备冻精对精子活力的影响从制备好的半支装和1支装冷冻精液中随机抽取各10支，设为半支剂量组和1支剂量组。冻精从液氮中取出后，在38 ℃恒温水浴中10 s进行解冻，利用显微镜分别检测两个剂量组的精子活力。1.2.3输精次数与剂量对受胎率的影响设自然发情组（A组）和同期发情组（B组），A组和B组发情母鹿各56只。A组和B组各自设置单次输精法和二次输精法，单次输精法再分为半支组和1支组，即A1组、A2组和B1组、B2组，每组10头发情母鹿；二次输精法再分为1支组（半支+半支）、1.5支组（1支＋半支）和2支组（1支＋1支），即A3组、A4组、A5组和B3组、B4组、B5组，每组12头发情母鹿。通过直肠把握法进行人工输精，输精后比较各组受胎率。自然发情组（A组）：通过公鹿试情的方法进行发情鉴定，在母鹿拒配3~4 h后，进行首次人工输精，8~10 h后进行二次输精。同期发情组（B组）：采用CIDR+PMSG+A3的同期发情方法，即将母鹿阴道埋入CIDR栓剂，12 d后麻醉取出，同时注射PMSG，取栓后60 h后进行人工输精，并肌肉注射A3，8~10 h后进行二次输精，并再次注射A3。受胎率=授精受胎数受配母鹿数×100%（1）1.2.4输精时的保定方式对受胎率的影响设立机械保定组和麻醉保定组，每组各30头发情母鹿。通过公鹿试情法进行人工输精，输精次数统一采用二次输精法（半支+半支），两次输精时间间隔8~10 h，通过直肠把握法进行人工输精，输精后比较两组受胎率。机械保定组：采用项目组自主研发的辅助生殖马鹿用采精授精自动保定装置（申请专利已受理），将发情母鹿引入该机械装置内，肌肉注射375 μg/m2镇静剂盐酸右美托咪定，10 min后进行人工输精。体面积计算公式如下：体面积（m2）=K×（体重克数2/3）×10-4 （2）式中：K值为常数，约取10。麻醉保定法[11]：发情母鹿通过麻醉进行人工输精。麻醉采用鹿眠宝和鹿醒宁；第一次麻醉：肌肉注射鹿眠宝3号1.2 mL/头，解药为肌肉注射鹿醒宝3号1.2 mL/头；第二次麻醉：肌肉注射鹿眠宝3号2 mL/头，解药为肌肉注射鹿醒宝3号2 mL/头。1.3数据统计与分析试验数据采用SPSS软件进行整理与分析，LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”及平均值表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1不同剂量制备冻精对精子活力的影响（见表1）由表1可知，半支剂量组与1支剂量组解冻后的平均精子活力差异不显著（P0.05）。结果表明，在冻精制备过程中，剂量的变化不会影响冻精解冻后的精子活力，因此，半支剂量的冻精可用于人工输精。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.002.T001表1不同剂量制备冻精对精子活力的影响Tab.1Effect of different doses of frozen sperm preparation on sperm motility组别冻精抽检数/支解冻后平均精子活力半支剂量组100.44±0.131支剂量组100.46±0.112.2不同发情方式条件下输精次数与剂量对受胎率的影响（见表2、表3）由表2、表3可知，当两种发情方式均采用单次输精法时，1支组的人工输精受胎率均极显著高于半支组（P0.01）；当两种发情方式均采用二次输精法时，采用“半支+半支”“1支+半支”“1支+1支”方式的人工输精受胎率均接近90%，但差异不显著（P0.05），其中“半支+半支”的冻精使用剂量较前两种方法更节省。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.002.T002表2自然发情条件下输精次数与剂量对受胎率的影响Tab.2Effect of frequency and dose of sperm transfusion on conception rate under natural estrus组别试验母鹿数/头受胎母鹿数/头受胎率/%母鹿来源A1组8562.5A令辉鹿场A2组9777.8B长峰鹿场A3组111090.9C长峰鹿场A4组9888.9C杜成鹿场A5组10990.0C杜成鹿场注 ：1.同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.自然发情组中去除了发生疾病和未发情的供试母鹿9头。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.002.T003表3同期发情条件下输精次数和剂量对受胎率的影响Tab.3Effect of spermatosus frequency and dose on conception rate under simultaneous estrus组别试验母鹿数/头受胎母鹿数/头受胎率/%母鹿来源B1组9667.6A永范鹿场B2组10880.0B青林鹿场B3组121191.7C胜全鹿场B4组111090.1C城郊鹿场B5组121191.7C城郊鹿场注 ：同情发情组中去除了发生疾病和未发情的供试母鹿2头。因此，自然发情和同期发情进行人工输精时，输精次数采用二次受精法，输精剂量选择“半支+半支”，为最佳的得出最佳的输精次数和输精剂量。2.3输精时不同保定方式对受胎率的影响（见表4）由表4可知，机械保定组母鹿的受胎率略高于麻醉保定组，但差异不显著（P0.05）。结果表明，人工输精时采取不同的保定方式对人工输精受胎率会产生一定影响，在保证较高受胎率的前提下，机械保定比麻醉保定更适用于人工输精。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.03.002.T004表4输精时不同保定方式对受胎率的影响Tab.4Effect of different guarantee methods on conception rate during spermatogysis组别试验母鹿数/头受胎母鹿数/头受胎率/%母鹿来源麻醉保定组282692.9清林家庭农场机械保定组302996.7荣海鹿场注 ：麻醉保定组去除了发生疾病的供试母鹿2头。3讨论3.1不同剂量冻精的制备对人工输精效果的影响对马鹿人进行人工输精时，精液通过母鹿生殖道到达受精部位的过程对精子的损耗很大，因此为确保在马鹿人工输入冻精后的受胎率，通常情况下要保证一次性的输精剂量[12-13]。但是，冻精制备时的质量不达标、精子活力不够以及对发情鉴定和输精时间把握不够准确均可影响受胎率，因此，盲目地保证冻精剂量会造成浪费。有研究表明，冻精解冻后，一次性输精的有效精子数量低于0.02亿/mL或精子活力小于0.3时会影响受胎率；而人工输入0.02亿/mL~0.08亿/mL的解冻冻精，其受胎率差异不显著[14]。本试验通过制备半支装冻精细管，探索一次性输精剂量减半时对精子活力和受胎率方面的影响。结果表明，半支装的冻精细管在冻精解冻后，有效精子数量高于0.04亿/mL，精子活力均高于0.4，与1支装精子活力相比差异不显著。通过合理地设计输精次数和方式，半支装的冻精同样可以保证较高的受胎率。因此，半支装冻精的制备在一次性输精剂量方面提供了更多的选择，使人工授精程序得到优化，进而最大程度节约优质品种公鹿精液，提高精液使用效率和效果。3.2输精的次数与剂量对受胎率的影响本研究通过对比同期发情、自然发情条件下不同输精次数、剂量对受胎率的影响，找出最佳的人工输精次数、剂量。在公鹿试情法进行人工输精时，因人工输精时的母鹿应激反应较大以及对母鹿发情鉴定把握不准确，单次输精存在覆盖授精能力时间段有限，错过了最佳输精时间的概率很大，易导致受胎率相对较低。通过同期发情法进行人工输精的马鹿也易在单次输精时出现受胎率相对较低的情况，主要由于同期发情时，固定的人工输精时间很难覆盖整个发情的时间区间，只能捕捉到区间内的一个时间范围，而且由于激素制剂的作用使母鹿在生理性发情率偏低，对受胎率存在一定限制。本试验结果显示，二次输精法可以覆盖更广泛的输精时间，大幅度提升受胎率。二次输精法中采用了半支剂量的冻精，在自然发情和同期发情两个发情方式中，“1支+1支”组、“1支+半支”组和“半支+半支”组的受胎率差异不显著，均极显著高于单次输精法。因此，考虑人工输精的整体效益，二次输精法以及该方法中“半支+半支”的输精剂量是提高受胎率的最优选择。3.3不同保定方式对人工输精后受胎率的影响马鹿身形硕大，人工输精需要在麻醉状态下进行。在输精操作中，麻醉耗时较长，在预留的麻醉时间内，容易造成错开或延误最佳输精时间。此外，麻醉造成的应激反应对发情、受精、胚胎着床以及胚胎发育均会产生一定的影响。有数据表明，当采用同期发情方法时，由于麻醉次数增加，受胎率会有所下降[15-16]。而且由于个体差异，麻醉还会导致中毒现象发生[17-18]。为了避免在人工输精中麻醉带来的弊端，本试验创制了一种机械保定法。该方法在传统保定器基础上进行了技术改良，采用半自动侧位挤压固定技术，增加了脖颈固定、胸腹部凹型托板，并设计减少应激的配套设施，优化了保定输精流程。在饲养圈、待配圈、繁殖圈和保定设施间采取闭合圈栏连接，通过多个轨道铁门进行驱赶目标母鹿，从饲养圈中选出符合配种母鹿，进行保定和首次人工输精，之后暂放于待配圈等待第二次输精，经两次输精后的母鹿再被调配至繁殖圈。机械保定装置不但在人工输精方面得到了很好的应用，在种公鹿的精液采集和鹿病治疗方面也比麻醉保定更具有明显优势。课题组实现了机械保定采精、输精技术的应用，同时还为病重鹿的输液、救治提供了技术支持。大量临床实践证明，机械保定装置可以减少麻醉带来的副作用，提高了种公鹿利用效率，为不适合多次麻醉的病重个体提供了新的保定手段。机械保定装置应用范围广泛，有效提高了马鹿养殖的经济效益。4结论本研究完成了清原马鹿人工输精的半支剂量的冻精细管的研发，提出了“半支+半支”的二次输精法，试验结果表明，该方法是清原马鹿人工输精的最佳输精方法和输精剂量。本研究也创制了清原马鹿的机械保定法，结果表明，在保证较高受胎率的前提下，机械保定比麻醉保定更适用于人工输精。