畜牧业是西藏地区农业经济的主导产业，对该地区的经济发展起到重要作用。但由于西藏特殊的自然环境，导致西藏地区可利用优质饲草料资源较少，饲草资源短缺已严重制约西藏畜牧业经济的发展。玉米青贮作为高质量的青贮饲料，具有抗病性、耐密性、抗倒性、后期持绿性好、生物产量较高、茎叶消化率高等优点[1]，具有较好的发展潜力。青贮玉米已在西藏多个地市（包括拉萨、林芝、昌都、山南等）广泛种植。因此，研究西藏地区青贮玉米加工技术，对缓解西藏粗饲料资源短缺、家畜“秋肥冬瘦”的现状具有现实意义。青贮能够最大限度地保存全株玉米的营养成分，改善全株玉米的适口性及营养物质的消化吸收率。青贮技术的推广有利于提高全株玉米的利用率，延长其保质期。饲料原料水分的含量是决定青贮是否成功的关键因素，若水分不足，原料青贮时就不易压实、空隙较大、氧气含量较多，乳酸菌繁殖缓慢，有害微生物活动加强，不利于青贮发酵进行；若水分太多，营养物质容易流失，发酵罐下部的青贮饲料就会过酸，容易引起醋酸发酵[2]。因此选择科学的青贮方式可有效保障青贮饲料的发酵品质。青贮玉米一般采用常规青贮或半干青贮的方式，常规青贮需要保持全株玉米含水量在65%~75%，而半干青贮需要保持全株玉米含水量在45%~55%，不同的含水量会影响全株玉米的发酵品质和菌群结构[3]。因此，本试验旨在研究常规青贮和半干青贮对西藏地区全株玉米青贮的发酵品质和微生物多样性的影响，为西藏地区全株玉米青贮的生产提供参考。1材料与方法1.1试验材料全株玉米在西藏林芝地区西藏农牧学院实习基地种植，于2020年4月种植，2020年10月刈割。玉米种植地（西藏林芝市）年降雨量约为650 mm，年均温度8.7 ℃，年平均日照为2 022.2 h，无霜期为180 d[4]，平均海拔3 000 m左右，是典型的温带季风气候。1.2试验设计将收割好的全株玉米用铡草机切割成1~2 cm的原料，充分混匀，控制水分，分别进行常规（水分含量70%左右）和半干（水分含量50%左右）青贮。分别将青贮原料装入5个2 000 mL密封的发酵瓶中，在厌氧条件下室温发酵。采用完全随机试验设计，设置2个全株玉米青贮组，分别为常规全株玉米青贮组（A组）和半干全株玉米青贮组（B组），每个青贮组设置5个重复。1.3样品采集青贮60 d，打开青贮窖，将所有的青贮饲料取出，混匀。取5 g青贮饲料样品装于试管中，-80 ℃保存，用于测定青贮饲料菌群结构[5]；剩余的玉米青贮饲料用去离子水提取，使用3~5层纱布过滤浸提液，将浸提好的溶液于冷冻冰箱储存，用于测定pH值和氨态氮含量。1.4测定指标及方法1.4.1青贮饲料发酵品质和营养成分样品各取1 000 g置于65 ℃烘箱中烘干至恒重，使用粉碎机直接将样品粉碎，过1 mm筛子，研磨得到风干样品。干物质（DM)、粗灰分（Ash)、粗脂肪（EE）参照张丽英[6]的方法测定；使用杜马斯定氮仪测定粗蛋白质（CP）含量；采用HANNA pH211精密pH计（意大利HANNA公司）对青贮样品处理后的过滤液接测定pH值；利用苯酚-次氯酸钠比色法测定青贮饲料过滤液氨态氮（NH3-N）含量[7]。1.4.2细菌测序与分析使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒提取全株玉米青贮饲料中的微生物组总DNA，Illumina平台对青贮饲料细菌16S rRNA基因V3-V4区域进行双端（Paired-end）测序，QIIME软件剔除错误和低质量序列，Vsearch软件对获得的序列进行聚类，根据97%的序列相似度对获得的序列进行操作分类单元（OTUs）划分，将OTU代表序列与对应数据库相比对，获取分类学信息[8]。利用6种多样性指数，包括Shannon、Simpson、Chao1、Observed species、Faith's PD和Pielou's evenness评定微生物的均匀度和丰富度；使用Venn图分析不同青贮组在属分类水平下的群落特征；通过主成分分析（PCoA）分析不同青贮饲料组样本间属分类水平下物种组成的差异。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel 2019软件进行汇总和整理，SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同青贮方式对全株玉米青贮发酵品质和营养成分的影响（见表1）由表1可知，A组全株玉米常规青贮的pH值显著低于B组（P0.05），但A组全干全株玉米青贮的pH值低于4.2，而B组半干青贮全株玉米的pH值高于4.2。半干青贮全株玉米的NH3-N含量显著高于常规青贮全株玉米（P0.05），且两种青贮方式的全株玉米NH3-N含量均低于100 g/kg。A组全株玉米常规青贮的DM、CP、Ash含量显著高于B组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.022.T001表1不同青贮方式对全株玉米青贮发酵品质和营养成分的影响组别pH值NH3-N/(100 g/kg)DM/%CP/%EE/%CF/%Ash/%A组3.35±0.01b32.34±2.13b67.60±0.04a5.00±0.17a0.62±0.0026.87±0.015.48±0.01aB组4.31±0.01a48.19±9.15a33.98±0.02b4.59±0.03b0.53±0.0026.51±0.014.81±0.00b注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2不同青贮方式对全株玉米青贮菌群结构OTU聚类的影响采用Illumina平台对全株玉米常规青贮饲料和半干青贮饲料细菌V3-V4区域进行测序，对获得的序列进行归纳整理，并按97%的相似度对OTU进行分类。在门、纲、目、科和属5个分类水平下所获得的OTU数量见图1[9]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.022.F001图1各分类等级所获得的OTUs数量由图1可知，常规青贮全株玉米组（A组）共鉴定出10个门、13个纲、31个目、170个科和343个属；常规青贮全株玉米组（B组）中共鉴定出10个门、12个纲、15个目、117个科和295个属。A组和B组中属分类水平下细菌群落的Venn图，见图2。由图2可知，两个试验组共计获得5 447个OTUs，A组共有4 061个OTUs，B组共有2 164个OTUs，B组获得OTUs的数量少于A组。A组和B组的共有OTUs为778个，而A组、B组独有OTUs分别为3 283、1 386个，独有OTUs多于共有OTUs，表明常规青贮全株玉米和半干青贮全株玉米细菌菌群结构存在差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.022.F002图2不同青贮方式全株玉米青贮细菌菌落在属水平下的Venn图2.3不同青贮方式对全株玉米青贮细菌菌群多样性的影响全株玉米常规青贮（A组）和半干青贮（B组）细菌菌群Alpha多样性指数见表2。由表2可知，A组和B组的Simpson指数分别为0.95、0.26，A组的Simpson指数显著高于B组（P0.05）；A组和B组的Shannon指数分别为6.42、1.41，A组Shannon指数显著高于B组（P0.05）；从Simpson、Shannon指数的变化情况分析，全株玉米常规青贮和半干青贮细菌菌群的表征多样性具有显著差异。A组和B组的Chao1指数分别为1 230.93、483.56，A组Chao1指数显著高于B组（P0.05）；A组和B组的Observed_species指数为1 071.25、412.43，A组Observed_species指数显著高于B组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.022.T002表2不同青贮方式对全株玉米青贮细菌Alpha多样性指数的影响组别Chao1Observed_speciesSimpsonShannonPielou_eFaith_pdA组1 230.93±105.75a1 071.25±97.76a0.95±0.01a6.42±0.40a0.63±0.03a98.90±6.25aB组483.56±42.59b412.43±32.53b0.26±0.11b1.41±0.37b0.16±0.04b55.21±2.06b由Chao1指数、Observed_species指数变化情况分析，全株玉米常规青贮和半干青贮细菌菌群的表征丰富度差异显著。Faith's PD指数和Pielou's evenness指数的变化规律与其他指数一致，表明全株玉米常规青贮和半干青贮细菌菌群进化的多样性和表征均匀度存在明显差异。通过主成分分析比较不同样本之间群落结构的相似性，结果见图3。由图3可知，全株玉米常规青贮和半干青贮细菌菌群群落聚集在不同的区域内，表明两种青贮方式全株玉米细菌菌群结构存在明显差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.022.F003图3不同青贮方式全株玉米青贮细菌群落PCoA图2.4不同青贮方式对全株玉米青贮细菌群落的影响（见表3）由表3可知，在门分类水平上，A组和B组的蓝细菌门、厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门存在明显差异，A组的蓝细菌门显著低于B组（P0.05），而厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门高于B组（P0.05）。在科分类水平上，A组叶绿体科的相对丰度显著低于B组（P0.05），而葡萄球菌科、乳杆菌科、毛螺旋菌科、丹毒丝菌科、明串珠菌科、莫拉菌科、肠杆菌科、伯克氏菌科和瘤胃菌科的相对丰度均显著高于B组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.022.T003表3不同青贮方式对全株玉米青贮细菌群落的影响项目细菌A组B组P值门水平蓝细菌门（Cyanobacteria）8.36±3.72b81.66±9.65a0.000厚壁菌门（Firmicutes）56.61±4.50a5.09±2.25b0.000变形菌门（Proteobacteria）19.08±4.15a8.88±6.73b0.020拟杆菌门（Bacteroidetes）5.13±2.32a1.76±0.85b0.016放线菌门（Actinobacteria）5.93±3.02a2.04±1.20b0.028续表3　不同青贮方式对全株玉米青贮细菌群落的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.022.T004项目细菌A组B组P 值科水平叶绿体科（Chloroplast）9.40±3.55b81.65±9.66a0.000葡萄球菌科（Staphylococcaceae）16.55±5.22a1.55±0.59b0.000乳杆菌科（Lactobacillaceae）10.03±6.30a1.17±0.58b0.014毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）10.06±4.26a0.80±0.37b0.001丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）8.09±2.68a1.21±0.38b0.000鼠杆菌科（Muribaculaceae）4.54±3.231.23±0.610.055明串珠菌科（Leuconostocaceae）5.33±3.57a0.11±0.07b0.011莫拉菌科（Moraxellaceae）3.62±1.66a0.50±0.26b0.003肠杆菌科（Enterobacteriaceae）3.47±2.41a0.16±0.06b0.016伯克氏菌科（Burkholderiaceae）2.84±1.20a0.65±0.32b0.004瘤胃菌科（Ruminococcaceae）2.50±1.25a0.53±0.31b0.009属水平叶绿体属（Chloroplast）9.00±4.22b81.65±9.66a0.000葡萄球菌属（Staphylococcus）16.88±5.13a1.21±0.81b0.000乳杆菌属（Lactobacillus）10.61±5.53a1.31±0.47b0.006毛螺旋菌属（Lachnospira）6.33±3.06a0.52±0.32b0.003明串珠菌属（Leuconostoc）6.01±3.62a0.59±0.27b0.010鼠杆菌属（Muribacula）3.89±2.42a1.32±0.57b0.050嗜冷菌属（Psychrobacter）3.24±1.02a0.28±0.10b0.000阿克曼氏菌属（Akkermansia）3.27±2.56a0.02±0.02b0.022鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）1.33±0.741.77±1.130.489棒杆菌属（Corynebacterium）2.36±1.49a0.43±0.27b0.022在属水平上，A组叶绿体属的相对丰度显著低于B组（P0.05），而葡萄球菌属、乳杆菌属、毛螺旋菌属、明串珠菌属、鼠杆菌属、嗜冷菌属、阿克曼氏菌属和棒杆菌属的相对丰度均显著高于B组（P0.05）。3讨论3.1不同青贮方式对全株玉米青贮发酵品质和营养成分的影响NH3-N是评价青贮饲料发酵品质的重要指标之一[10]，其占比直接影响青贮饲料的适口性和营养价值，NH3-N值低表明全株玉米发酵过程中蛋白质分解较少，青贮发酵品质较好[11]。本研究中，常规青贮NH3-N显著低于半干青贮，可能是低水分青贮时，因其水分含量少，植物细胞的渗透压达到55×105~60×105 Pa，在此情况下，腐败菌、酪酸菌以及乳酸菌的生命活动类似于生理上的干燥状态，其生长性能和繁殖性能受到限制[12]。pH值可以直接反映青贮饲料发酵是否成功，当pH值下降时，可以在发酵过程中减少有害微生物的活性从而使饲料长期保存，优质的青贮饲料pH值为3.8~4.5。本研究中，常规青贮和半干青贮的饲料pH值均低于4.2，符合优质青贮饲料质量标准，其半干青贮pH值高于常规青贮。但玉柱等[12]研究发现，低水分青贮的品质优于常规青贮的品质，原因是降低原料的含水量可以浓缩可溶性碳水化合物等营养物质，这些营养物质是青贮饲料发酵的基础，可为微生物的繁殖和发酵活动提供营养，从而显著提高青贮饲料的质量[13]。本研究常规青贮pH值低于半干青贮可能是低水分青贮高度厌氧环境阻止了喜高水分的梭菌的活动，阻碍了酪酸的产生和蛋白的分解，使蛋白质和氨基酸分解较少，其酸环境相对不如常规青贮，取用时易腐败。蛋白比值高表明饲料的适口性和营养价值高。本试验中，常规青贮的蛋白含量高于半干青贮，可能是因为半干的方式导致水分减少，少量的蛋白质被分解成以氨基酸为基础的氨酸盐以维持细胞的生命活动[14]。3.2不同青贮方式对全株玉米青贮菌群结构的影响青贮是一个非常复杂的微生物活动过程，在青贮过程中微生物群结构的变化会对青贮饲料的发酵质量产生很大影响[15]。本研究中，常规青贮和半干青贮全株玉米的菌群结构明显不同，与程光民等[15]研究发现不同加工处理方式会影响全株玉米青贮饲料微生物变化规律和贾森等[16]研究得到不同青贮方式会对全株玉米青贮饲料微生物的相对丰度产生影响的结果一致，可能与常规青贮和半干青贮全株玉米水分含量不同，而青贮原料水分含量会影响青贮过程中微生物的活性有关。本试验发现，蓝细菌门、厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门市全株玉米青贮的主要菌门，与商振达等[17]研究发现变形菌门、厚壁菌门、蓝细菌门、放线菌门和拟杆菌门是西藏地区青贮玉米发酵饲料优势菌门的结果一致。厚壁菌门是革兰氏阳性菌，主要包括梭菌纲、芽孢杆菌纲和柔膜菌纲，很多芽孢杆菌可降解大分子营养物质，如纤维素、蛋白质和淀粉等[18]；拟杆菌门包含多种专性厌氧杆菌，可代谢碳水化合物产酸有机酸，有利于青贮的进行[19]。本研究发现，常规青贮全株玉米厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度均显著高于半干青贮全株玉米，说明常规青贮全株玉米对粗纤维的降解效果和碳水化合物的利用效果优于半干青贮全株玉米。乳酸菌在青贮过程中起到关键性的作用，可直接影响青贮饲料的发酵质量[20]。常规青贮全株玉米中常见的产乳酸菌的菌种，如乳杆菌属、毛螺旋菌属和明串珠菌属的相对丰度均显著高于半干青贮全株玉米[21]，表明常规青贮全株玉米的产生乳酸的能力更强，可降低青贮过程中的pH值，抑制有害细菌的增长，有利于青贮进行，提高全株玉米青贮饲料的品质。本研究发现，青贮方式可以显著影响全株玉米的葡萄球菌属、鼠杆菌属、嗜冷菌属、阿克曼氏菌属、鞘氨醇单胞菌属和棒杆菌属的相对丰度，但这些菌属的具体功能还需进一步研究。4结论本试验结果表明，全株玉米常规青贮的pH值和氨态氮显著低于半干青贮，且全株玉米常规青贮中产乳酸的菌群相对丰度高于半干青贮。因此，全株玉米采用常规青贮的方式更合适。