柚子营养价值丰富、经常被加工成果汁、饮料和罐头等，加工之后产生大量柚皮副产品，约占水果质量的30%~50%。研究表明，新鲜柚皮富含多种营养成分和功能性化合物，如膳食纤维、果胶、精油以及多酚类化学物质[1]，这些成分具有抗炎[2]、抗肿瘤[3]、抗凝血、抗菌和抗氧化等多种生物活性[4]。琯溪蜜柚是我国福建省的特产，果皮橙黄鲜艳，芳香浓郁，其中精油主要存在于表皮中。柚皮精油是一类具有芳香气味的化合物，常应用于食品和日用品中[5]。在畜禽饲料中适量添加植物精油能够提高动物的生产性能，改善畜产品品质，有效减少饲料中养分的损失。房灿等[6]研究表明，百里香和肉桂精油具改善反刍动物瘤胃发酵的潜力。周鹏等[7]研究表明，植物精油具有抗菌、杀菌、抗氧化以及增强机体免疫力等生物学功能。因此，柚皮精油作为畜禽饲料原料可以减少环境污染，促进柚皮的精细利用，提高养殖效益。超声波辅助提取是利用超声波引起的强振动、高速度和强烈空化效应等，加快有效成分向溶剂中的迁移，以达到提高产量、减少提取时间和避免高温影响提取成分的目的[8]。与单一提取方法相比，采用两种或两种以上工艺结合，如结合超声波、微波、酶及其他辅助方法进行提取，可提高精油的产率和纯度。本试验以琯溪蜜柚柚皮为研究对象，利用超声波辅助索氏提取法研究柚皮精油的方法，采用响应面法对提取工艺进行优化，确定最佳工艺条件，并对其成分进行鉴定，为琯溪蜜柚精油的提取及其在动物生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂外皮无损伤、无腐败的琯溪蜜柚（产自福建），购自锦州大润发超市；无水硫酸钠、石油醚、无水乙醇均为分析纯，购自天津市天力化学试剂有限公司。1.2主要仪器设备DHG-9140型电热鼓风干燥箱；XD-52AA型旋转蒸发器；KQ3200DV型数控超声波清洗器；FW100型高速万能粉碎机；安捷伦7890B 7000C气质联用仪；索氏提取器。1.3测定指标及方法1.3.1琯溪蜜柚粉末样品的制备琯溪蜜柚熟果经去瓤后的果皮，使用手术刀分离外黄皮和白色内瓤，将外黄皮切成宽为3 cm的长条，烘箱55 ℃干燥至恒重，粉碎，过40目，于棕色密封瓶中2~4 ℃低温保存。1.3.2琯溪蜜柚精油的提取采用赵虹桥等[9]的方法提取精油，计算精油得率，并结合实际进行了优化调整。准确称取12.5 g的琯溪蜜柚皮粉末置于烧杯中，加入100 mL石油醚，将烧杯置于超声波清洗器中以一定的超声功率、超声一段时间后，在一定温度下索氏提取一定时间，提取液进行旋转蒸发得到柚皮精油粗提取品。将上一步制得的柚皮精油粗品加入适量的无水乙醇冲洗及定量无水硫酸钠，置于-20 ℃冰箱中冷冻过夜，真空抽滤后进行旋转蒸发得到柚皮精油。精油得率=G1/G2×100%(1)式中：G1为柚皮精油质量；G2为柚皮粉质量。1.3.3单因素试验除变量外控制其他因素不变，研究液料比（6、8、10、12、14 mL/g）、超声时间（15、20、25、30、35 min）、超声波功率（150、175、200、225、250 W）、索氏提取时间（20、30、40、50、60 h）对柚皮精油提取率的影响。对各因素进行最优水平筛选，在单因素试验的基础上设计了响应面试验，得到最优提取工艺。1.3.4响应面试验为进一步研究各因素交互作用对精油得率的影响，采用响应面分析法优化最佳提取工艺。在Box-Behnken试验设计的基础上，选取液料比（A）、索氏提取时间（B）、超声功率（C）、超声时间（D）进行4因素3水平响应面分析试验。响应面试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.T001表1响应面因素水平设计水平A/(mL/g)B/minC/WD/min-16201752008302002511040225301.3.5成分分析参考文献[10]至文献[11]等方法使用气相色谱-质谱联检测方法并加以优化，色谱柱HP-5ms（60 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气。程序升温，初温40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至220 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至300 ℃，保持5 min，进样口温度270 ℃，进样量1 μL，分流比20∶1。质谱参数：电离方式为EI，离子源温度200 ℃，倍增器电压0.70 kV，质量扫描范围50~500 amu，利用仪器所附谱库进行质谱图解[12]。1.3.6最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）测定在无菌的每孔最终体积为200 μL的96孔板中进行测定，精油溶解于吐温80在LB肉汤培养基中进行2倍系列稀释。将菌液稀释到一定倍数，每孔包括用LB肉汤培养基稀释的精油100 µL、生长培养基（Luria-Bertani培养基）80 µL和细胞悬液（106 µL/mL）20 µL。以LB培养基中的细菌为阳性对照，以吐温80为阴性对照。在37 ℃孵育24 h，加入25 µL 0.5 g/L 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5二苯四唑溴化铵（MTT）。活细胞与MTT反应产生紫色。为估算MIC，从每孔中取20 μL，在LB培养皿上均匀分布，无明显生长。MIC是在37 ℃孵育24 h，能够杀灭99%培养基内细菌的最低浓度。MIC值和MBC值的测定以mL/L为单位重复进行[13-14]。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1不同液料比对柚皮精油提取得率的影响（见图1）由图1可知，当其他因素不变的情况下，液料比为6~8 mL/g时，柚皮精油得率逐渐上升，而液料比大于8 mL/g后，精油得率缓慢下降。这是由于萃取溶剂石油醚用量降低，柚皮粉不能得到充分浸润，当萃取溶剂的用量增大时，增大了柚皮粉与萃取溶剂的接触面积，更有利于精油的萃取。但液料比过大时，液料浓缩时间会加长同时导致油量损耗，造成精油得率降低。因此，柚皮精油提取的最佳液料比为8 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.F001图1不同液料比对柚皮精油提取得率的影响2.1.2不同超声时间对柚皮精油提取得率的影响（见图2）由图2可知，随着超声时间的增加，柚皮精油的得率在逐步增加，超声时间25 min时达到顶峰，得率为1.272%，超声时间超过25 min后得率缓慢下降，这可能是因为超声时间过长会导致精油中的挥发性物质溢出，精油得率降低，超声35 min的提取率与25 min接近。因此，为节省资源考虑选取超声时间25 min进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.F002图2不同超声时间对柚皮精油提取得率的影响2.1.3不同超声功率对柚皮精油提取得率的影响（见图3）由图3可知，超声功率越大，柚皮精油的提取得率越高，超声功率为200 W时柚皮精油的提取得率最高，达到1.272%。超声功率超过200 W，柚皮精油的提取得率明显降低，原因是超声功率越大，吸收的超声波能量越多，对细胞壁的破坏越有利，越利于精油萃取。但当功率超过200 W时可能会造成能量损失，使精油的产率下降。因此，柚皮精油的最佳超声功率为200 W。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.F003图3不同超声功率对柚皮精油提取得率的影响2.1.4不同提取时间对柚皮精油提取得率的影响（见图4）由图4可知，随着索氏提取时间的不断增大，柚皮中精油的提取率呈现先上升后下降的趋势，当索氏提取时间为30 min时，精油提取率最高。这是因为索氏提取时间过长容易使挥发性物质逸出，对柚皮精油的浸出率有一定的影响。因此索氏提取30 min是柚皮精油的最佳的索氏提取时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.F004图4不同索氏提取时间对柚皮精油提取得率的影响2.2响应面试验及方差分析结果2.2.1响应面试验结果（见表2）由表2可知，利用Design-Expert 10.0.3软件对试验数据进行分析，得到二次多项式回归方程为：10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.T002表2响应面试验结果试验号A/(mL/g)B/minC/WD/minY精油得率/%1-1-1000.98200110.99310011.094100-10.78500001.27600-110.957-11001.13800001.299-10101.0510001-11.041111001.021200001.311310-100.93140-1011.0115-100-10.91160-1-100.69170-10-10.711801100.94190-1101.152010101.16211-1001.112200001.282300-1-10.642401011.0425-10-100.952601-101.122700001.3428-10011.0229010-11.00Y=1.298 0+0.00 416 667A+0.05B+0.087 5C+0.085D-0.06AB+0.032 50AC+0.05AD-0.16BC-0.065BD-0.09CD-0.108 167A2-0.136 917B2-0.173 167C2-0.226 917D2。方差分析结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.T003表3方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值显著性合计0.91028回归模型0.88140.06338.280.0001**A2.083×10-412.083×10-40.130.727 4B0.03010.03018.220.000 8**C0.09210.09255.790.000 1**D0.08710.08752.650.000 1**AB0.01410.0148.740.010 4*AC4.225×10-314.225×10-32.570.131 5AD0.01010.0106.070.027 3*BC0.10010.10062.180.000 1**BD0.01710.01710.260.006 4*CD0.03210.03219.670.000 6**A20.07610.07646.080.000 1**B20.12010.12073.840.000 1**C20.19010.190118.110.000 1**D20.33010.330202.820.000 1**残差0.023141.647×10-3失拟项0.020101.997×10-32.590.185 7纯误差3.080×10-347.700×10-4注：R2=0.974 5，Radj2=0.949 1，RPred2=0.867 6。由表3可知，根据F值判断，不同生产工艺条件对精油的得率的影响排序为CDBA。试验模型的显著性P0.05，认为该模型具有统计学意义，本模型的判定因子R2=0.974 5，表明模型的显著性很高，Radj2=0.949 1与RPred2相近，表明所建立的模型符合实际情况，可用于实际操作，从而对精油的最佳提取工艺进行分析和预报。2.2.2各交互作用对柚皮精油提取得率的影响（见图5~图10）由图5可知，而液料比和索氏提取时间的相互作用对精油产率的影响呈抛物型曲线，其总体纵向跨度大，等高线呈椭圆状，表明两者的相互作用对精油的得率有显著的影响精油得率随液料比和索氏提取时间的增加均呈先增后减变化趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.F005图5液料比和索氏提取时间的交互作用对柚皮精油得率的影响由图6可知，液料比和超声功率交互曲面中，精油得率结果随液料比和超声功率的增加呈现先增后减变化规律，超声功率方向曲面波动幅度更大，表明其对精油得率影响较液料比影响更显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.F006图6液料比和超声功率的交互作用对柚皮精油得率的影响由图7可知，精油得率随液料比和超声时间增加均呈先增后减变化，且随超声时间的变化趋势更加显著，表明超声时间对精油得率的影响较液料比影响显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.F007图7液料比和超声时间的交互作用对柚皮精油得率的影响由图8可知，交互等高线是一个显著椭圆形，且3D曲面纵向跨度较大，表明索氏提取时间与超声波的相互作用对精油的得率有明显影响，索氏提取时间小于30 min时，索氏提取时间与精油的得率成正比；而在索氏提取时间超过30 min，两者间的相关性出现转变，在30 min左右提取时间附近取值时为精油得率的临界最佳工艺参数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.F008图8索氏提取时间和超声功率的交互作用对柚皮精油得率的影响由图9可知，索氏提取时间和超声时间对精油得率的影响呈抛物曲面分布，超声时间为精油得率的敏感影响因子。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.F009图9索氏提取时间和超声时间的交互作用对柚皮精油得率的影响由图10可知，两者的相互作用曲线呈明显的椭圆状，超声波功率和超声波时间对精油的得率有很大的影响，表现为精油得率随超声功率和超声时间的增加呈现先增后减变化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.F010图10超声功率和超声时间的交互作用对柚皮精油得率的影响2.2.3验证试验结果为协同考虑各因素之间的交互作用对精油得率的影响，以最大精油得率为优化目标，根据Design-Expert 10.0.3软件运行结果，精油得率在液料比、索氏时间、超声功率、超声时间等因素共同影响下的最优提取工艺。根据软件预测结果，结合实际工艺设置的可行性，取液料比8 mL/g、索氏提取时间30 min、超声功率206 W、超声时间26 min为条件进行3次平行试验，得平均精油得率为1.36%，与模型预测结果接近，表明基于该响应面模型分析优化精油得率最佳工艺有效可行。2.3柚皮精油组成成分分析结果利用GC-MS对柚皮精油进行成分分析，总离子流色谱结果见图11。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.F011图11总离子流色谱图经过对各色谱峰的检索，鉴定出38种主要成分，各主要成分见表4。柚皮精油的成分较复杂，包括烷烯烃类、醇类、醚类、酮类、酯类和酚类等物质，其中醚类占28.94%，酯类占19.82%，醇类占13.84%，酮类占12.57%，烷烯烃类占10.33%，研究表明，圆柚酮占8.76%被认为是柚皮精油香味的主要贡献成分[15-17]。在已经鉴定的柚皮精油成分中，有多种化合物是制造香料与药物的重要原料，如圆柚酮具浓郁的柑橘果香，可用于配制柑橘型香精。柚皮精油混合体，除以上鉴定成分外，还存在其他复杂的化合物，还需要多种鉴定方法的配合，未来需要进一步探索。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.T004表4柚皮精油化学成分分析结果序号保留时间/min相对峰面积/%名称19.3670.343-环己烯-1-甲醇212.7350.051,3,5(10)-雌甾三烯-17-酮313.0050.212,6-二甲基-2,4,6-辛三烯414.2730.04Γ-杜松烯514.9331.01Γ-杜松烯615.0780.13Γ-杜松烯715.4000.04Γ-杜松烯816.6980.033-(丁基苯氨基)丙腈917.0860.36Γ-杜松烯1018.6948.76圆柚酮1119.4990.02溴代环戊烷1219.7200.022-己基吡啶1320.0313.80β-红没药烯1420.1461.24邻苯二甲酸二丁酯1520.3901.24β-红没药烯1622.1580.90亚油酸1722.3842.23蛇床子素1823.68226.71蛇床子素1924.1181.46(+)-荷包牡丹碱2025.1980.16花椒毒醇2125.5190.05抗氧剂22462226.1900.99抗氧化剂10102327.46716.31橙皮油内酯2427.9380.20正二十四烷2528.6041.01橙皮油内酯2629.0033.05角鲨烯2730.5210.231,2-环氧十八烷2831.0020.43D-γ-生育酚2931.1820.27Β-谷甾醇乙酸酯3031.4052.16维生素E2.4柚皮精油抑菌测定结果（见表5）由表5可知，柚皮精油对金黄色葡萄球菌有明显抑菌作用，柚皮精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉菌的MIC值分别为50.00、25.00、12.50、6.25 mL/L，MBC值分别为50.00、50.00、25.00、6.25 mL/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.016.T005表5柚皮精油抑菌测定结果菌种MICMBC大肠杆菌50.0050.00金黄色葡萄球菌25.0050.00黑曲霉菌12.5025.00枯草芽孢杆菌6.256.25mL/L3结论本试验采用单因素试验和响应面对超声波辅助索氏提取柚皮精油的工艺条件进行优化，所得最佳提取工艺条件为：液料比8 mL/g、索氏提取时间30 min、超声功率206 W、超声时间26 min。该条件下，柚皮中精油的提取率可以达到1.36%，优化方案合理。应用GC-MS技术进行分析，从提取的柚皮精油中鉴定出38种主要成分，包括烷烯烃类、醇类、醚类、酮类、酯类和酚类等物质。柚皮精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉均具有较强的抑菌活性。