蛋白质合成和降解协同作用可以控制肌肉增加或减少，绝大多数已知的调节蛋白质合成的机制涉及蛋白质翻译的起始阶段[1]。真核起始因子（eIFs）主要有12种参与调节mRNA翻译过程的起始阶段，包括eIF-1、eIF-1A、eIF-2、eIF-2B、eIF-3、eIF-4A、eIF-4E、eIF-4G、eIF-4B、eIF-4H、eIF-5和eIF-5B[2]。翻译启动过程由43S预起始复合物引发，该复合物又由小核糖体亚单位（40S）及相关因子组成。eIF-2B催化（eIF2·GDP）复合物中GTP与GDP的交换重新激活eIF-2，从而促进Met-tRNA·eIF-2·GTP三元复合物的形成，再与eIF-5、eIF-3、eIF-1和eIF-1A结合40S形成43S预启动复合物[3]。mRNA通过在5'端帽子（m7GpppN cap）结合eIF-4F和在3'端结合polyA结合蛋白被激活，其中eIF-4F由eIF-4E、eIF-4A和eIF-4G组成[2]。eIF-4A解开mRNA二级结构，使其与43S预启动复合物形成复合体。eIF-4E是帽结合蛋白，是eIF-4的调控中心，其活性因磷酸化而增加[4]。此外，eIF-4B和eIF-4H通过促进ATP水解与RNA解旋的偶联而激活eIF-4A[5]。乌金猪是云南优良的地方猪种之一，具有抗逆性强、耐粗饲、肉质细嫩等性状[6]。日粮组成及营养水平的改变能够影响动物生长速率和胴体组成[7]。前期研究表明，高能量日粮可显著提高乌金猪肌内脂肪含量，促进背最长肌肌内脂肪沉积相关基因的表达水平[8]。目前，已有关于氨基酸调节猪骨骼肌蛋白质合成作用的研究[9]。Sarri等[10]研究表明，日粮蛋白质水平降低2%能够提高生长猪的平均日增重和饲料转化率，蛋白质代谢更活跃。但关于日粮能量水平对蛋白质沉积的影响还未阐明。因此，本试验研究日粮能量水平对乌金猪肌肉组织部分蛋白质翻译起始因子（eIF-2B、eIF-4A、eIF-4B和eIF-4E）基因表达的影响，揭示日粮能量水平对猪肌肉组织蛋白质沉积影响的机制，为营养调控肌肉蛋白质的沉积提供参考。1材料与方法1.1试验设计选取健康、胎次相近、体重约15 kg的乌金猪54头（公、母各半），随机分为3组，每组3个重复，每个重复6头。各组饲喂不同能量水平的日粮，试验分15~30、31~60、61~100 kg 3个阶段。每日饲喂3次，自由饮水。各阶段换料过渡期为7 d，分别于试验猪30、60、100 kg时分批屠宰。1.2试验日粮试验日粮组成及营养水平与前期研究一致[11]。根据中国肉脂型生长肥育猪饲养标准[12]设计乌金猪各生长阶段日粮，每阶段日粮除能量水平不同外，其他营养水平基本一致。3个能量水平由低到高为11.74、12.98、14.22 MJ/kg。15~30 kg粗蛋白水平为18.74%，31~60 kg为粗蛋白水平为16.47%，61~100 kg粗蛋白水平为14.28%。1.3样品采集30、60、100 kg体重时分批屠宰，低能量组、中能量组、高能量组每批分别屠宰6头，计算瘦肉率和脂肪率。取左侧胴体10~11肋骨间部分背最长肌组织，装入5 mL冻存管，置于液氮中转移至-80 ℃冰箱中保存，11肋骨后切下5 cm的背最长肌组织装入自封袋，用于测定营养成分。1.4测定指标及方法1.4.1瘦肉率和脂肪率计算按《瘦肉型猪胴体性状测定技术规范》[13]计算瘦肉率和脂肪率。1.4.2背最长肌营养成分参照AOAC方法[14]测定背最长肌中粗蛋白和粗脂肪含量，参照Bruns等[15]的方法测定背最长肌肌内脂肪含量。1.4.3背最长肌组织4种eIFs基因表达量1.4.3.1总RNA提取取0.1 g肌肉组织样品，根据TRIzol™ Reagent RNA提取试剂（Invitrogen，美国）说明书提取总RNA，使用紫外分光光度计（260 nm）测定总RNA浓度与纯度。1.4%琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带。1.4.3.2反转录根据测定浓度进行反转录，先加RNA模板，dNTP和随机引物，70 ℃变性5 min，加RNA酶抑制剂、反转录酶和5×RT Buffer 37 ℃反应60 min，95 ℃灭活5 min。1.4.3.3引物设计所有基因的引物使用Primer v5.0软件设计，目的基因和内标基因（18S rRNA）的引物序列根据GenBank上猪的基因序列设计，引物登录号及引物序列见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.007.T001表1内标基因和目的基因的引物序列、产物长度及登录号基因名称引物序列退火温度/℃产物长度/bpGenBank登录号eIF-2BF：5'-GCCAAGAAGCGATTTAGTGT-3'R：5'-CTGGTTTAGTGGAAAGAGCC-3'51300NM_001414eIF-4AF：5'-TAAGCCGAGGGTTCAAGGAT-3'R：5'-GGTCAGCGTCTCATACAAGTC-3'60251NM_144958eIF-4BF：5'-GCTGATGAAACGGATGACCT-3'R：5'-ATCCCTGTCTTTATCCTGTGCT-3'48420BC098437eIF-4EF：5'-TTCTCCAATAAGGCACAG-3'R：5'-CCCCTACTCCTAATCCC-3'59395NM_00196818S rRNAF：5'-GCGGCTTTGGTGACTCTA-3'R：5'-CTGCCTCCTTGGATGTG-3'同目的基因195AY2653501.4.3.4电泳及灰度分析取20 µL PCR产物，采用EB染色的2.0%琼脂糖凝胶电泳，TANON电泳凝胶成像系统分析条带灰度，结果用目的基因条带净灰度与18S条带净灰度的比值表示。1.5数据统计与分析试验数据采用SPSS 22.0和Excel软件进行统计分析，GraphPad Prism 8软件作图。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1不同能量水平日粮对乌金猪瘦肉率和脂肪率的影响（见图1）由图1（a）可知，各屠宰体重阶段，试验猪的瘦肉率随能量水平降低而升高。30 kg屠宰体重，低能量组试验猪的瘦肉率显著高于高能量组（P0.05）。60 kg屠宰体重，低能量组试验猪的瘦肉率极显著高于高能量组（P0.01），显著高于中能量组（P0.05）。100 kg屠宰体重，低能量组和中能量组试验猪的瘦肉率显著高于高能量组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.007.F001图1不同能量水平日粮对乌金猪瘦肉率和脂肪率的影响注：不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），无字母表示差异不显著（P0.05）；下图同。由图1（b）可知，各屠宰体重阶段脂肪率随能量水平降低而降低。60 kg屠宰体重高能量组试验猪脂肪率极显著高于低能量组（P0.01）。100 kg屠宰体重，高能量组、中能量组试验猪脂肪率极显著高于低能量组（P0.01）。2.2不同能量水平日粮对乌金猪背最长肌营养成分的影响（见图2）由图2（a）可知，猪背最长肌的粗脂肪和肌内脂肪含量随能量水平降低而降低，高能量组猪背最长肌的粗脂肪和肌内脂肪含量显著高于低能量组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.007.F002图2不同能量水平日粮对乌金猪背最长肌营养成分的影响由图2（b）可知，60 kg屠宰体重，猪背最长肌粗蛋白和肌内脂肪含量变化趋势与30 kg一致，高能量组猪背最长肌粗脂肪含量极显著高于低能量组（P0.01）。由图2（c）可知，100 kg屠宰体重低能量组猪背最长肌粗蛋白含量显著高于高能量组（P0.05）；高能量组猪背最长肌粗脂肪和肌内脂肪含量极显著高于低能量组（P0.01）。2.3不同能量水平日粮对乌金猪4种翻译起始因子基因表达的影响2.3.1不同能量水平日粮对乌金猪eIF-2B基因表达量的影响（见图3）由图3可知，屠宰体重为30 kg时，高能量组猪eIF-2B表达水平显著低于低能量组（P0.05）。屠宰体重为60 kg时，高能量组和中能量组猪eIF-2B表达水平显著低于低能量组（P0.05）。eIF-2B表达水平随着能量水平升高而降低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.007.F003图3不同能量水平日粮对乌金猪eIF-2B基因表达量的影响2.3.2不同能量水平日粮对乌金猪eIF-4A基因表达量的影响（见图4）由图4可知，eIF-4A相对表达水平随着日粮能量水平升高而降低。屠宰体重为100 kg时，低能量组和中能量组eIF-4A相对表达水平显著高于高能量组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.007.F004图4不同能量水平日粮对乌金猪eIF-4A基因表达量的影响2.3.3不同能量水平日粮对乌金猪eIF-4B表达量的影响（见图5）由图5可知，30 kg屠宰时，低能量组猪的eIF-4B基因表达量显著高于中能量组（P0.05），中能量组猪的eIF-4B基因表达量显著高于高能量组（P0.05）。60 kg和100 kg屠宰时，低能量组猪的eIF-4B基因表达量显著高于中能量组和高能量组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.007.F005图5不同能量水平日粮对乌金猪eIF-4B基因表达量的影响2.3.4不同能量水平日粮对乌金猪eIF-4E基因表达量的影响（见图6）由图6可知，30 kg屠宰体重，低能量组猪的eIF-4E相对表达量显著高于高能量组（P0.05）；60、100 kg屠宰体重，低能量组猪的eIF-4E相对表达量显著高于中能量组和高能量组（P0.05），100 kg屠宰体重中，中能量组猪的eIF-4E相对表达量显著高于高能量组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.007.F006图6不同能量水平日粮对乌金猪eIF-4E基因表达量的影响3讨论3.1日粮能量水平对乌金猪胴体品质的影响张曦等[16]研究表明，日粮消化能为12.98 MJ/kg的30~100 kg乌金猪日采食量和料重比显著高于日粮消化能为14.22 MJ/kg。Van等[17]研究发现，日粮能量水平为10.2、8.8 MJ/kg对猪的日增重、日采食量、饲料转化率和瘦肉率无显著影响。日粮能量水平为13.81、14.23 MJ/kg对泌乳母猪的体重、背膘厚和日采食量几乎无影响[18]。唐显作等[19]研究发现，降低能量水平可以提高猪胴体的瘦肉率。有研究表示，降低日粮能量和蛋白质水平对宁乡猪生长性能和肉品质无负面影响，对提高屠宰性能和改善胴体组成具有积极意义[20]。杨国明等[21]对日粮中能量对乌金猪胴体品质影响的研究也得出相近结论。本试验结果显示，乌金猪不同生长阶段的瘦肉率随日粮能量水平升高而降低，表明日粮能量水平可能影响肌肉组织蛋白沉积过程。3.2日粮能量水平对乌金猪营养成分的影响本试验结果显示，乌金猪不同生长阶段的粗脂肪和肌内脂肪含量随能量水平升高而升高，粗蛋白水平反之。有研究设置13.68、13.88、14.09、14.51 MJ/kg等4个消化能水平，发现育肥猪的皮脂率和肌内脂肪含量随消化能水平升高而明显提高[22]，与本试验结果一致。Van等[17]研究发现，日粮能量水平为10.2、8.8 MJ/kg对猪肌内脂肪和蛋白质含量几乎无影响。唐敏等[23]研究发现，高营养水平（消化能13.11 MJ/kg，粗蛋白质14.73%）能够在一定程度上提高瘦肉率、肌内脂肪含量和氨基酸总量，显著降低脂肪率。3.3日粮能量水平对乌金猪蛋白质翻译起始因子基因的影响蛋白质合成的起始是将80S核糖体与mRNA和引发剂Met-tRNAi结合在一起的过程[24]。结合后的Met-tRNAi在开放阅读框的起始位置识别并进行密码子-反密码子碱基对交互，肽链开始合成[25]。eIFs在蛋白质翻译起始过程起到关键作用。有研究表明，与正常仔猪相比，出生体重低的仔猪eIF-4A、eIF-4E和eIF-4G丰度更低，导致eIF-4F数量有限，蛋白质翻译受限，肌肉生长较缓慢[26]。前期研究表明，高蛋白饮食能够显著提高乌金猪30~100 kg阶段胴体瘦肉重量，主要是通过上调eIF-2B、eIF-4B和eIF-4E的表达促进猪肌肉蛋白质的沉积[27]。本试验结果显示，随着日粮能量水平升高，乌金猪的蛋白质合成相关的翻译起始因子eIF-2B、eIF-4A、eIF-4B、eIF-4E的相对表达水平均受到抑制，降低了蛋白质翻译速率，减少肌肉组织中蛋白质的沉积。结果表明，随着日粮能量水平降低，蛋白质沉积效率会增加，但是低能量水平对蛋白质降解速率几乎无影响，乌金猪蛋白质合成速率随日粮能量水平的增加而降低。4结论本研究结果表明，乌金猪背最长肌蛋白质沉积随日粮能量水平降低而升高，肌内脂肪含量反之。日粮不同能量水平可通过调节蛋白质合成翻译起始因子基因的表达显著影响乌金猪肌肉组织蛋白质的合成。