博落回（Macleaya cordata (Willd.) R.Br.）为罂粟科博落回属植物，主要活性成分为原阿片碱、别隐品碱、血根碱、白屈菜红碱等异喹啉类生物碱。博落回具有抑菌消炎、杀虫、抗肿瘤等多种药理作用[1-2]。博落回及其提取物已经在养殖业中广泛应用[3]。研究表明，博落回提取物可提高荷斯坦犊牛生长性能，改善血清生化指标[4]；提高母猪生产性能[5]；博落回提取物可以提高肉鸡的生产性能[6]；显著改善蛋鸡的蛋品质[7]。博落回提取物可调控肠道微生物菌群，提高日粮养分表观消化率[8]，对多种水产寄生虫具有杀灭作用[9]，还具有低残留、安全等特点[10]。博落回散已注册为我国二类新兽药，欧盟已注册博落回提取物列为天然诱食剂[11]。目前，博落回生物碱提取工艺的研究主要集中在果实、叶部位。闵江等[12]、梁浩等[13]采用0.5%硫酸浸提博落回果荚中血根碱、白屈菜红碱等生物碱。关于博落回根部分的生物碱提取及工艺优化报道较少。余坤等[14]从鲜博落回根中分离得到6种生物碱。陶志杰等[15]使用超声波法提取根中总碱，但其仅采用称重法评估总生物碱得率，易受杂质干扰，而博落回提取物一般采用HPLC法定量分析其中的生物碱类成分。本试验采用HPLC测定博落回提取液中原阿片碱、别隐品碱含量，采用单因素试验和正交试验探究最佳提取工艺，采用最佳提取工艺制备提取物，经硅胶柱层析纯化后，采用紫外光谱、红外光谱进行表征，为博落回根原阿片碱、别隐品碱的提取提供参考。1材料与方法1.1试验材料博落回根经武汉东湖学院金卫华讲师鉴定为罂粟科博落回属植物博落回的干燥根。1.2仪器与试剂1.2.1仪器LY22-500A型超声波清洗机（上海兰仪实业有限公司）、LC-100高效液相色谱仪（上海伍丰科学仪器有限公司）、600A粉碎机（浙江荣浩工贸有限公司）、ZT-2L旋转蒸发仪（郑州紫拓仪器设备有限公司）、分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、SHZ-D循环水真空泵（郑州杜甫仪器厂）、普通天平（上海衡平仪器仪表厂）、SP-1901UV型紫外可见光度计（上海光谱仪器厂）、Nicolet iS5型红外光谱仪（赛默飞世尔科技）。1.2.2主要试剂原阿片碱标准品（批号：PCS-210415）购自成都植标化纯生物，甲醇、二氯甲烷、乙醇、氢氧化钠、硫酸、盐酸、乙腈、磷酸购自国药集团化学试剂有限公司，溴化钾购自天津天光光学仪器，薄层色谱硅胶板购自青岛海洋化工有限公司，柱层析硅胶（100~200目）购自上海盛亚化工有限公司。1.3测定指标及方法1.3.1色谱条件参考文献[16]并稍作调整，设定色谱条件。色谱柱为Welch Materials XB-C18 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液25∶75，流速为0.8 mL/min，检测波长为284 nm，柱温为35 °C，进样量为20 μL。根据文献[16]可知，该色谱条件下别隐品碱保留时间应为原阿片碱的1.18~1.22倍，因此可定位别隐品碱保留时间。1.3.2对照样品溶液的制备取0.36 g/L原阿片碱1 mL，1∶1的1%盐酸-甲醇定容至5 mL，取0.2、0.4、0.6、0.8 mL溶液，使用1∶1的1%盐酸-甲醇定容至5 mL，得到2.88、5.76、8.64、11.52、72.00 mg/L溶液，0.22 μm滤膜过滤，得对照样品溶液。1.3.3标准曲线取1.3.2中2.88、5.76、8.64、11.52、72.00 mg/L的原阿片碱标准溶液，按1.3.1中色谱条件进样，绘制峰面积-浓度标准曲线。参考[16]的计算方法，结合所得回归方程，计算待测液中原阿片碱、别隐品碱含量。Ws=(As-5 081.8)/2 633.7(1)Wm=(Ws×Ak)/(fP/A×As)(2)式中：Ws为原阿片碱浓度（mg/L）；Wm为别隐品碱浓度（mg/L）；Ak为别隐品碱峰面积；fP/A为校正因子，为0.7；As为原阿片碱峰面积。1.3.4原阿片碱、别隐品碱提取率计算使用1∶4的1 mol/L HCl-乙醇提取，博落回根粉碎，过50目筛，称取3份0.50 g博落回根粉末，置于50 mL容量瓶中，加入45 mL HCl-乙醇超声1.5 h，定容至刻度线，取该溶液0.5 mL，1∶11%盐酸-甲醇定容至5 mL，0.22 μm滤膜过滤，使用液相色谱检测两种生物碱含量，取3份样品中两生物碱含量的平均值，并以此质量浓度为基准计算原阿片碱、别隐品碱的提取率。Ws'=(Ws/1 000)×100%(3)Wm'=(Wm/1 000)×100%(4)式中：Ws'为原阿片碱含量（%）；Wm'为别隐品碱含量（%）。Ws''=Ws2/Ws1×100%(5)Wm''=Wm2/Wm1×100%(6)式中：Ws''为原阿片碱提取率（%）；Wm''为别隐品碱提取率（%）；Ws1为3份样品液中原阿片碱浓度均值（mg/L）；Ws2为不同处理方法的样品液中原阿片碱质量浓度（mg/L）；Wm1为3份样品液中别隐品碱浓度均值（mg/L）；Wm2为不同处理方法的样品液中别隐品碱浓度（mg/L）。1.3.5单因素试验1.3.5.1提取时间对原阿片碱和别隐品碱提取率的影响称取5份0.50 g过50目筛的博落回根粉末，设置液料比20 mL/g，提取次数1次，分别提取15、30、45、60、75、90 min，抽滤，取滤液定容于50 mL容量瓶中；取该溶液0.5 mL，1∶1的1%盐酸-甲醇定容至5 mL，0.22 μm滤膜过滤，液相色谱检测原阿片碱和别隐品碱浓度，计算原阿片碱和别隐品碱提取率。1.3.5.2液料比对原阿片碱和别隐品碱提取率的影响称取5份0.50 g过50目筛的博落回根粉末，设置提取时间60 min，提取次数1次，分别于液料比10、15、20、25、30 mL/g提取，抽滤，取滤液定容于50 mL容量瓶中，取该溶液0.5 mL，1∶1的1%盐酸-甲醇定容至5 mL，0.22 μm滤膜过滤，液相色谱检测原阿片碱和别隐品碱浓度，计算原阿片碱和别隐品碱提取率。1.3.5.3提取次数对原阿片碱和别隐品碱提取率的影响称取5份0.50 g过50目筛的博落回根粉末，设置提取时间为60 min，液料比20 mL/g，分别于提取次数1、2、3、4次提取，抽滤，取滤液定容于50 mL容量瓶中，取该溶液0.5 mL，1∶1的1%盐酸-甲醇定容至5 mL，0.22 μm滤膜过滤，液相色谱检测原阿片碱和别隐品碱浓度，计算原阿片碱和别隐品碱提取率。1.3.6正交试验设计选取单因素试验中3个因素的最佳水平，设计L9(34)的正交试验。因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.T001表1正交试验因素水平设计水平液料比/(mL/g)提取时间/min提取次数1201512253023304531.4原阿片碱、别隐品碱生物碱的纯化1.4.1总生物碱样品的制备称取5.00 g博落回根粉末，采用正交试验中最佳条件提取后，蒸发乙醇，残留物调节pH值为11，二氯甲烷萃取，蒸发二氯甲烷至小体积，加入一定量柱层析硅胶粉，用于纯化硅胶层析，另取该二氯甲烷溶液用于TLC检验。精密称取0.500 0 g该硅胶粉末，置于25 mL容量瓶，加1∶1的1%盐酸-甲醇定容刻度，超声1.5 h，计算两种生物碱含量。1.4.2纯化条件的选择参考文献[17]采用TLC法探究两种溶剂体系，环己烷∶丙酮=3∶2、石油醚∶丙酮=3∶2分离别隐品碱和原阿片碱的效果，取1.3.2中制备的原阿片碱标准品溶液和1.4.1中总生物碱二氯甲烷溶液各2 μL用于TLC点样，流动相中添加0.1%三乙胺，观察别隐品碱和原阿片碱是否分离。显色剂为碘化铋钾。1.4.3硅胶柱层析纯化方法精密称取0.500 0 g 1.4.1中制备的硅胶粉末，干法上样；色谱柱直径2 cm，设置柱径比为8∶1，流动相为石油醚∶丙酮=3∶2（流动相中添加0.1%三乙胺），TLC检验，合并相同斑点组分，蒸发称重，计算产率和表征。1.4.4产物的表征计算1.4.4.1液相色谱称取纯化所得原阿片碱7 mg，别隐品碱5.3 mg，分别加1∶1的1%盐酸-甲醇定容刻度至50 mL，超声0.5 h，按1.3.4中方法计算两种生物碱含量。1.4.4.2紫外光谱乙醇溶解纯化所得的原阿片碱、别隐品碱，在200~400 nm范围内进行光谱扫描。1.4.4.3红外光谱采用溴化钾压片法进行红外光谱检测。2结果与分析2.1原阿片碱和样品色谱测定结果（见图1~图3）由图1可知，空白溶剂无干扰。由图2可知，原阿片碱保留时间为14.42 min。由图3可知，原阿片碱和别隐品碱色谱峰分离良好，且别隐品碱保留时间为17.03 min，别隐品碱与原阿片碱保留时间比值为1.8，符合文献[16]中1.80~1.22的比值范围。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.F001图1阴性对照色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.F002图2原阿片碱标准溶液色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.F003图3样品溶液中原阿片碱和别隐品碱色谱图2.2原阿片碱标准曲线测定结果（见图4）由图4可知，原阿片碱标准曲线的回归方程为y=2 633.7x+5 081.8，R=0.999 5，表明原阿片碱质量浓度在2.88~72.00 mg/L范围内线性关系良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.F004图4原阿片碱标准曲线测定结果2.3单因素试验结果2.3.1提取时间对原阿片碱和别隐品碱提取率的影响（见图5）由图5可知，别隐品碱提取的最佳提取时间为15、30、45 min；原阿片碱的最佳提取时间为30、45、60 min，但提取60 min原阿片碱提取率为70.59%，且15 min提取率为66.20%，二者提取率相近，因此选择提取时间为15、30、45 min进行后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.F005图5提取时间对两生物碱提取率的影响2.3.2液料比对原阿片碱和别隐品碱提取率的影响（见图6）由图6可知，液料比为25 mL/g时，两种生物碱提取率最高，因此选择液料比为20、25、30 mL/g进行试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.F006图6液料比对两种生物碱提取率的影响2.3.3提取次数对原阿片碱和别隐品碱提取率的影响（见图7）由图7可知，提取2次时，原阿片碱、别隐品碱提取率最高，故选择提取次数为1、2、3次进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.F007图7提取次数对两种生物碱提取率的影响2.4正交试验及方差分析结果（见表2~表4）由表2可知，根据R值判断各因素对两种生物碱提取率的影响排序为液料比、提取时间、提取次数。由表3、表4可知，仅液料比对两种生物碱提取率的影响达到了显著水平，因此，为了减少操作步骤和提取时间，仅将液料比设置为最高水平，提取次数、提取时间设置最低水平，即液料比30 mL/g，提取1次，提取时间为15 min，取提取率平均值，原阿片碱提取率为92.64%，别隐品碱为90.93%。比表2中最佳条件有所下降，但15、30 min相差较小，在实际提取过程中可适当延长提取时间以提高提取率，故最终确定最佳提取条件为液料比30 g/mL、提取1次、提取时间30 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.T002表2正交试验结果项目提取次数提取时间/min液料比/(mL/g)提取率/%原阿片碱别隐品碱13452072.9069.7921303099.1998.9833153098.0897.0941452588.9386.2552453097.0296.6563302588.5285.7172302078.2778.6182152583.4585.5091152065.0965.34原阿片碱k184.40382.20772.087k286.24788.66086.967k386.50086.28398.097R2.0976.45326.010别隐品碱k'183.52382.64371.247k'286.92087.76785.820k'384.19784.23097.573R'3.3975.12426.32610.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.T003表3原阿片碱提取率正交试验方差分析结果项目Ⅲ类平方和自由度均方F值P值提取次数7.85823.9290.2120.825提取时间63.913231.9571.7240.367液料比1 021.8112510.90627.5670.035误差37.066218.53310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.T004表4别隐品碱提取率正交试验方差分析结果项目Ⅲ类平方和自由度均方F值P值提取次数19.40729.7040.5720.636提取时间41.274220.6371.2170.451液料比1 043.6162521.80830.7740.031误差33.912216.9562.5原阿片碱和别隐的纯化和产物的表征2.5.1两种溶剂体系TLC测定结果（见图8）由图8可知，环己烷-丙酮体系、石油醚-丙酮体系中原阿片碱、别隐品碱分离程度好，参考文献[17]可知，别隐品碱Rf值约为原阿片碱的1/2，由此定位别隐品碱位置。环己烷-丙酮体系中原阿片碱Rf值为0.300，环己烷-丙酮体系中原阿片碱Rf值为0.275，两种体系均符合柱色谱分离中溶剂体系对TLC结果中Rf值0.200~0.300的要求，因此实际纯化过程中环己烷和石油醚可互相代替。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.F008图8两种溶剂体系TLC结果注：A为石油醚∶丙酮=3∶2；B为环己烷∶丙酮=3∶2；1为原阿片碱标准溶液；2为博落回样品溶液；3为别隐品碱。2.5.2原阿片碱、别隐品碱的液相色谱检测结果（见图9、图10）根据硅胶粉末的两生物碱含量为基准计算柱层析纯化后两生物碱收得率，峰面积归一法计算纯化所得两生物碱HPLC含量。由图9可知，原阿片碱、别隐品碱柱层析纯化收得率分别为78.49%、79.44%，纯化所得的原阿片碱、别隐品碱含量分别为90.40%、81.82%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.F009图9纯化所得原阿片碱液相色谱图由图10可知，纯化所得别隐品碱存在原阿片碱杂质，表明本试验条件下的硅胶柱层析方法无法将别隐品碱与原阿片碱完全分离。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.F010图10纯化所得别隐品碱液相色谱图2.5.3原阿片碱、别隐品碱紫外光谱测定结果（见图11、图12）由图11、图12可知，原阿片碱、别隐品碱分别在284、289 nm处存在吸收峰，与文献[18]至文献[19]报道数值基本一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.F011图11纯化所得原阿片碱紫外光谱结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.018.F012图12纯化所得别隐品碱紫外光谱结果2.5.4原阿片碱、别隐品碱红外光谱测定结果由红外光谱测定结果发现，产物原阿片碱在1 672、1 612 cm-1处，别隐品碱在1 640 cm-1处存在羰基特征吸收峰，与文献[20]报道的数值基本一致。因此，可确定纯化所得产物为原阿片碱和别隐品碱。3结论本试验通过超声波辅助提取法对博落回根中原阿片碱、别隐品碱进行提取，经正交试验优化了最佳提取条件为液料比30 mL/g，提取1次，提取时间30 min，明显增加了提取溶剂的用量，缩短了提取时间，且提取溶剂乙醇可回收重复使用。因此，本试验可为研究博落回根中原阿片碱、别隐品碱的提取工艺提供一种简单、快速的方法，为博落回根药材资源的利用提供参考。