我国是农业大国，每年玉米、小麦、水稻等农作物秸秆产量高达10亿t，但大量的农作物秸秆被随意丢弃、堆积、焚烧，带来持续的环境污染和资源浪费[1-2]。我国居民日常膳食中动物性食品占比逐年增加，由此带来饲料用粮比例不断提高[3-5]。秸秆作为饲料可为草食动物提供粗蛋白、粗纤维及多种矿物元素[6-7]。秸秆资源饲料化有助于缓解我国畜牧业饲料原料不足和秸秆类废弃物污染问题，推动生态文明建设[8]。秸秆主要由纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质和灰分组成，其中纤维素含量占30%~40%。纤维素是由葡萄糖单元通过β-1,4-糖苷键连接而成，其结构致密，难以被牲畜消化利用，成为秸秆饲料化的难点[9-10]。在瘤胃内产琥珀酸丝状杆菌能够降解结构致密的纤维素[11]，因此，瘤胃液可对秸秆中的纤维素进行分解。产琥珀酸丝状杆菌采用不同于游离纤维素酶降解机制和纤维小体降解机制的第三种纤维素降解策略高效降解纤维素[12]。本文将以纤维素酶系和外膜蛋白为出发点介绍产琥珀酸丝状杆菌纤维素降解机制的研究进展，总结产琥珀酸丝状杆菌在秸秆饲料化中的应用研究进展，为推动秸秆饲料的高效利用提供参考。1微生物降解纤维素的机制自然界的微生物进化出多种不同的纤维素降解机制[13-14]。研究发现，一些好氧微生物采用游离纤维素酶协同降解机制；一些厌氧微生物采用纤维小体降解机制[15]。此外在一些细菌中包括产琥珀酸丝状杆菌采用新型第三种纤维素降解机制。游离纤维素酶协同降解机制和纤维小体降解机制见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.026.F001图1游离纤维素酶协同和纤维小体降解机制1.1游离纤维素酶协同降解机制和纤维小体降解机制一些好氧细菌和真菌通过向胞外分泌可协同作用的纤维素酶降解纤维素，该机制称为游离纤维素酶协同降解机制[16-17]。游离纤维素酶通过协同作用降解纤维素的效率明显高于单一纤维素酶的效率。其降解纤维素的模式见图1（a）。一些厌氧微生物是通过位于细胞表面的纤维素酶复合体（纤维小体）完成纤维素降解，该机制称为纤维小体降解机制[18]。其纤维小体的典型结构见图1（b）。1.2第三种纤维素降解机制少数微生物产琥珀酸丝状杆菌和哈氏噬纤维菌（Cytophaga hutchinsonii）也可以快速彻底地降解纤维素。产琥珀酸丝状杆菌是牛瘤胃中分离的可高效降解纤维素的厌氧细菌，见图2[19-20]。哈氏噬纤维菌是土壤中分离的好氧细菌[21]。有研究表明，产琥珀酸丝状杆菌和哈氏噬纤维菌在降解纤维素时不向胞外大量分泌纤维素酶；并且基因组分析显示产琥珀酸丝状杆菌和哈氏噬纤维菌没有编码cohesin和dockerin等能够组成纤维小体的蛋白成分[22-23]。产琥珀酸丝状杆菌和哈氏噬纤维菌采用的是不同于游离纤维素酶协同机制和纤维小体机制的新型第三种纤维素降解机制。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.026.F002图2扫描电子显微镜观察产琥珀酸丝状杆菌降解纤维素Wilson等[13-14]综合哈氏噬纤维菌降解纤维素的特点推测当哈氏噬纤维菌菌体在纤维素上运动时，细胞外膜蛋白或者蛋白复合体把纤维素单链从结晶纤维素中剥离出来并通过外膜通道运送到周质空间，进而被位于周质空间的纤维素酶降解。Zhu等[24]研究发现，位于周质空间的纤维素内切酶CHU_2103和CHU_1280在哈氏噬纤维菌纤维素降解过程中的重要性，进一步验证了Wilson模型。目前，Wilson模型中涉及到能够剥离纤维素链的外膜蛋白和转运纤维素链的外膜通道蛋白仍未得到有效的实验验证。同样是采用第三种纤维素降解机制，产琥珀酸丝状杆菌和哈氏噬纤维菌降解纤维素时有所差别。产琥珀酸丝状杆菌不能在纤维素链上有效滑动，降解之后形成沟壑状的纤维素表面（见图2）[20]。哈氏噬纤维菌可在纤维素链上快速滑动，使哈氏噬纤维菌可以吸附并降解不同区域的纤维素，形成平整的纤维素表面[21,25]。研究发现，产琥珀酸丝状杆菌在降解纤维素时需要菌体和纤维素的直接接触，但在细胞发酵液中未检测到明显的纤维素酶活[26]。2产琥珀酸丝状杆菌中的纤维素酶系2.1组学分析产琥珀酸丝状杆菌中的纤维素酶产琥珀酸丝状杆菌S85基因组分析结果表明，该菌缺少破坏纤维素结晶区的外切葡聚糖酶和持续性催化内切酶的基因，产琥珀酸丝状杆菌采用新策略破解纤维素结晶区[27,12]。分别以硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷和羧甲基纤维素钠为底物检测产琥珀酸丝状杆菌外膜和周质空间的β-葡萄糖苷酶和纤维素内切酶酶活，结果显示大部分纤维素酶活都分布于细胞外膜，预示外膜纤维素酶的关键作用。在产琥珀酸丝状杆菌转录组中，共发现172个基因编码，203个碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active enzymes，CAZy），见图3[20]。在所有样本中最高基因表达的CAZy基因是Fisuc_3111，并且Fisuc_3111的表达变异系数也相对较低。此外，Fisuc_3111是第一个从产琥珀酸丝状杆菌S85中纯化的内切纤维素酶，第一个主要的纤维素结合蛋白[28]。研究表明，产琥珀酸丝状杆菌不采用CBM模式结合纤维素，可能是采用兼具结合和降解作用的纤维素酶作用于纤维素[29]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.026.F003图3基于CAZy确定的GH家族成员和BLAST分析的糖苷水解酶类注：从最外圈到最内圈的箭头：1为所有注释的CAZymes；2为纤维素降解酶；3为木聚糖降解酶；4为其他酶类。2.2产琥珀酸丝状杆菌降解纤维素时多种纤维素酶表达量的变化分别以葡萄糖和纤维素为唯一碳源培养产琥珀酸丝状杆菌，发现Fisuc_0207、Fisuc_1860和Fisuc_2230等基因在葡萄糖中的相对表达量降低，在纤维素中表达增加[30-31]。在纤维素降解过程中，转录组分析发现一些木质纤维素降解酶的表达量变化明显[32]。在不同碳源中，产琥珀酸丝状杆菌的纤维素酶基因表达量不同，说明纤维素酶的表达受到底物的调控。2.3产琥珀酸丝状杆菌中纤维素酶的体外表达和酶学特点目前已从产琥珀酸丝状杆菌中分离出数种纤维素酶类并测得了酶活性[33-35]。Fisuc_0897，Fisuc_0207、Fisuc_1859、Fisuc_3111等纤维素酶，体外纤维素酶活力不高而且对于结晶纤维素几乎没有降解作用[36-38]。异源表达得到的纤维素酶没有表现出预期的特殊纤维素酶学性质，因此不能从单个纤维素酶探索产琥珀酸丝状杆菌纤维素酶作用机制，几个异源表达的纤维素酶协同效应也不明显[28]。一方面可能由于人工纤维素酶组合的随机性；另一方面纤维素酶在产琥珀酸丝状杆菌中的位置不同无法形成有效的协同作用。所以目前对于产琥珀酸丝状杆菌独特纤维素酶系仍然缺少整体的把握。2.4产琥珀酸丝状杆菌降解纤维素时外膜蛋白的作用产琥珀酸丝状杆菌可以吸附和解构结晶纤维素，但是基因组分析显产琥珀酸丝状杆菌缺少编码CBM的基因序列，且产琥珀酸丝状杆菌菌体表面也缺少可执行吸附作用的多糖等结构[39]。研究发现，在高离子强度、戊二醛、或胰蛋白酶等作用下，产琥珀酸丝状杆菌的细胞外膜蛋白受到干扰或破坏，其吸附和解构结晶纤维素的能力急速下降[40]。产琥珀酸丝状杆菌在降解结晶纤维素时需要菌体表面与结晶纤维素的直接接触[41]，产琥珀酸丝状杆菌的外膜可能存在未被鉴定的吸附和结构纤维素的蛋白。目前已经发现fibro-slim蛋白、Fisuc_3111、Fisuc_0251-Fisuc_0253、Fisuc_0956等外膜蛋白，可能与吸附结晶纤维素有关[30]。蛋白组学分析显示产琥珀酸丝状杆菌的外膜共鉴定到185个蛋白，生物信息学预测其中有25个蛋白可能参与吸附和解构结晶纤维素，43个蛋白可能参与能量传递和蛋白质与蛋白质之间的相互作用。但是生物信息学预测的蛋白并未得到有效的实验验证，同时是否还有其他未鉴定的外膜蛋白参与吸附和解构结晶纤维素尚不清楚，这些蛋白吸附和解构结晶纤维素的机制有待深入探讨。外膜囊泡是革兰氏阴性菌细胞外膜出芽形成的特殊囊泡状结构，外膜囊泡中通常包括外膜蛋白、细胞壁成分、周质空间蛋白等成分[42-43]。研究表明，产琥珀酸丝状杆菌的外膜囊泡能够降解无定形纤维素，并且在外膜囊泡中发现了纤维素结合蛋白相关的复合体，表明外膜囊泡降解纤维素的能力可能与纤维素结合蛋白复合体相关[44]。Wilson降解模型、哈氏噬纤维菌的外膜蛋白复合体模式以及外膜囊泡中的蛋白复合体，均在暗示外膜可能形成了与降解纤维素相关的纤维素结合蛋白复合体[21,45-46]。3产琥珀酸丝状杆菌在秸秆饲料化中的应用农作物秸秆纤维素含量高，不易被动物消化，是秸秆饲料化的难点[47-48]。反刍动物瘤胃内含有多种纤维素分解菌，其中产琥珀酸丝状杆菌是瘤胃内纤维素分解的优势菌种。基因组分析显示产琥珀酸丝状杆菌不仅有纤维素酶基因，也含有果胶酶、葡聚糖苷酶、阿拉伯半乳聚糖酶和木聚糖酶等多种多聚糖酶基因，为产琥珀酸丝状杆菌能够降解秸秆中的半纤维素和纤维素提供了保证。研究发现，通过调控瘤胃微生物中产琥珀酸丝状杆菌的数量，改善瘤胃功能，可提高反刍动物对秸秆饲料利用率[49-50]。在玉米秸秆青贮时加入菊粉、蛋氨酸等外源物质，可显著提高反刍动物瘤胃中产琥珀酸丝状杆菌的数量，并使秸秆中木质纤维素的降解率提高，进一步改善了反刍动物对于秸秆饲料的利用率，提升了饲料品质[51-52]。在饲料中添加低聚糖，可提高羔羊瘤胃总菌和产琥珀酸丝状杆菌的数量，增强了饲料利用率和羔羊的生产性能。使用白腐真菌处理大豆秸秆之后，可增加纤维降解菌产琥珀酸丝状杆菌的数量，提高了牛奶产量[53-54]。研究发现，在饲料中添加纤维素酶可改善饲料营养价值、提高饲料消化率和利用率、促进动物生长等[55]。牛瘤胃中纤维二糖水解酶基因的重组乳酸菌应用于玉米秸秆青贮过程中，有利于促进秸秆纤维素酶解及提高青贮饲料的营养价值[56]。杨玉霞等[57]在毕赤酵母中的表达产琥珀酸丝状杆菌β－葡聚糖酶基因，该葡聚糖酶作为饲用酶制剂具有潜在的应用价值。在秸秆青贮中添加纤维素酶，可改善秸秆的饲料品质，提高畜禽的生长性能[58-60]。产琥珀酸丝状杆菌能够高效降解木质纤维素，产琥珀酸丝状杆菌中相关木质纤维素酶的异源表达，将为饲料添加酶提供可靠的基因背景。4展望产琥珀酸丝状杆菌采用不同于游离纤维素酶协同机制和纤维小体机制的第三种纤维素降解机制高效降解纤维素。独特的纤维素酶系、外膜纤维素吸附蛋白及外膜囊泡中的纤维素结合形成蛋白复合体。未来产琥珀酸丝状杆菌纤维素降解机制可通过建立有效的遗传学操作体系来明确参与纤维素吸附和解构的外膜蛋白，进一步解析参与纤维素降解的外膜蛋白复合体。产琥珀酸丝状杆菌秸秆饲料化应用过程中，可从以下几个方面着手：以瘤胃中的高效纤维素降解菌如产琥珀酸丝状杆菌制备菌剂，应用于秸秆青贮发酵中，以期促进秸秆粗纤维素的降解，提高发酵品质，改善饲料的营养价值；以产琥珀酸丝状杆菌中纤维素酶基因为背景，开发性价比高的纤维素酶，以降低纤维素酶添加剂在秸秆饲料中的应用成本；产琥珀酸丝状杆菌单一纤维素酶对于纤维素的降解能力不佳，可考虑多种纤维素酶组合表达，在秸秆饲料中添加混合酶制剂。