我国是畜禽养殖大国，也是兽用抗生素生产和使用大国。兽用抗生素在防治动物疾病、提高养殖效益、保障畜禽产品有效供给中发挥了重要作用[1]。但抗生素滥用引发了药物残留、细菌耐药性等问题，严重威胁畜产品质量安全和公共卫生安全，对人类和动物健康具有不利影响[2]。小麦低聚肽是以小麦蛋白（又称谷朊粉）为原料，经水解制得的小分子肽类混合物[3]。制备小麦低聚肽的方法有蛋白酶酶解法、DNA重组技术合成法、微生物发酵法等[4]，其中使用蛋白酶对谷朊粉进行定向酶切的研究较多。小麦低聚肽不仅具有很好的抗氧化、调节免疫、调节血液胆固醇、抗过敏等功能[5-6]，其含有的谷氨酰胺肽也具有减轻胃肠道负担、为机体提供均衡蛋白质等作用[7]。小麦低聚肽作为饲料添加剂[8]具有极好的水溶性、易于动物机体的吸收[9-10]。小麦低聚肽作为植物活性肽能够刺激机体淋巴细胞增殖，增强巨噬细胞的吞噬功能，提高机体抗感染能力[11]及免疫力[12]，作为饲料添加剂具有广泛的应用前景[13]。目前，我国小麦低聚肽主要应用的酶制剂均为高活性食品级蛋白酶，但由于高活性的食品级蛋白酶价格昂贵，严重影响小麦低聚肽作为饲料添加剂使用，关于使用低活性、相对廉价的饲料级蛋白酶的研究较少[14]。本试验使用饲料级蛋白酶水解谷朊粉得到饲用小麦低聚肽，为饲用小麦低聚肽在动物生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料谷朊粉购自卫辉市康迪粉业有限公司，饲料级碱性蛋白酶、中性蛋白酶（10万U/g）购自山东隆科特酶制剂有限公司，食品级碱性蛋白酶、中性蛋白酶（10万U/g）购自南宁庞博生物工程有限公司，三氯乙酸（TCA）购自福晨（天津）试剂有限公司，细胞色素C标准品（相对分子质量12 500 Da）购自中国生物制品检定所，抑肽酶标准品（相对分子质量6 500 Da）购自中国计量科学研究院，杆菌肽标准品（相对分子质量1 450 Da）购自上海源叶生物科技有限公司，乙氨酰氨-乙氨酰氨-精氨酸标准品（相对分子质量451 Da）购自中国计量科学研究院，乙氨酰氨-乙氨酰氨-乙氨酸标准品（相对分子质量189 Da）购自中国计量科学研究院。1.2主要仪器ME204E电子分析天平购自梅特勒-托利多公司，TG16-WG台式高速离心机购自湘仪离心机仪器有限公司，高效液相色谱仪LC-20A购自岛津公司，TSKgel G2000SWXL色谱柱购自Tosho公司。1.3测定指标及方法1.3.1酶的筛选准确称取5 g谷朊粉，缓慢加入至45 mL纯净水中，制备质量浓度为0.1 g/mL的蛋白溶液。使用0.1 mol/L NaOH溶液将蛋白溶液pH值调至8.0，温度为50 ℃，分别加入碱性蛋白酶、中性蛋白酶进行酶解，饲料级碱性蛋白酶与中性蛋白酶为组1，食品级碱性蛋白酶与中性蛋白酶为组2。1.3.2可溶性小肽含量1.3.2.1酸溶蛋白的测定称取0.2 g样品，在50 mL离心管中加入5 mL水溶解充分，加入15%三氯乙酸（TCA）溶液5 mL，充分混匀，静置10 min，9 000 r/min离心10 min，取出全部离心清液。使用凯氏定氮法测定清液的蛋白质含量，计算样品中酸溶蛋白含量，单位g/100 g。1.3.2.2蛋白质的测定参考《饲料中粗蛋白的测定 凯氏定氮法》（GB/T 6432—2018）测定样品中的蛋白质，单位g/100 g。1.3.2.3可溶性小肽含量按照公式（1）计算可溶性小肽含量。TCA-NSI=N1/N2×100%(1)式中：TCA-NSI为三氯乙酸可溶性氮得率（%）；N1为在15％TCA中的可溶性氮（mg）；N2为原料中的总氮（mg）。1.3.3单因素试验分别测定谷朊粉添加量、pH值、酶添加量、水解时间、水解温度对小麦低聚肽中多肽含量的影响。通过添加不同水平谷朊粉判断其最适添加量。以8%、10%、12%、14%的谷朊粉添加量调浆混合均匀，在调浆过程中，添加8%谷朊粉不易结团，较为均匀的分布在水中，添加12%谷朊粉，结团情况有所严重。使用0.1 moL/L NaOH分别调节pH值至8.0，各添加3%中性蛋白酶与碱性蛋白酶，在50 ℃的条件下水解4 h，测定酸溶蛋白与游离氨基酸含量，计算可溶性小肽含量。通过酸碱调节的pH值，添加10%谷朊粉调浆，混匀，使用0.1 moL/L NaOH分别调节pH值至6、7、8、9，各添加3%中性蛋白酶与碱性蛋白酶，在50 ℃条件下水解4 h，测定酸溶蛋白与游离氨基酸含量，计算可溶性小肽含量。添加不同水平蛋白酶判断最适酶添加量，添加10%谷朊粉调浆，混匀，使用0.1 mol/L NaOH分别调节pH值至8.0，各添加4%、5%、6%、7%中性蛋白酶与碱性蛋白酶，在50 ℃的条件下水解4 h，测定酸溶蛋白与游离氨基酸含量，计算可溶性小肽含量。水解时间的不同会改变可溶性小肽含量，添加10%谷朊粉调浆，混匀，使用0.1 mol/L NaOH分别调节pH值至8.0，各添加3%中性蛋白酶与碱性蛋白酶，在50 ℃的条件下分别水解2、3、4、5 h，测定酸溶蛋白与游离氨基酸含量，计算可溶性小肽含量。水解反应过程中，需要保温水浴一定的温度。以10%的谷朊粉调浆，混匀，使用0.1 mol/L NaOH分别调节pH值至8.0，各添加3%中性蛋白酶与碱性蛋白酶，分别在45、50、55、60 ℃的条件下水解4 h，测定酸溶蛋白与游离氨基酸含量，计算可溶性小肽含量。1.3.4正交试验法优化水解工艺参数以谷朊粉添加量、pH值、酶添加量、水解时间为考察对象，以多肽含量为参考标准，采用4因素3水平L9（34）的正交试验法优化小麦低聚肽的水解工艺参数，正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.014.T001表1正交试验因素水平设计水平A谷朊粉添加量/%B pH值C酶添加量/%D水解时间/h187532108643129751.3.5小麦低聚肽分子量使用细胞色素C标准品、抑肽酶标准品、杆菌肽标准品、乙氨酰氨-乙氨酰氨-精氨酸标准品、乙氨酰氨-乙氨酰氨-乙氨酸标准品为标准品作校正曲线。取10 μm小麦低聚肽样品加入色谱柱中，选取含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液为流动相，设置流速为0.5 mL/min，持续洗脱65 min，于波长220 nm处检测吸光值。根据保留时间、峰面积、高度以及含量，利用回归方程计算小麦低聚肽的相对分子质量分布。2结果与分析2.1两组不同蛋白酶水解谷朊粉的多肽含量测定结果（见表2）由表2可知，组1水解谷朊粉多肽含量为74.37 g/100 g，组2水解谷朊粉的多肽含量为74.11 g/100 g。饲料级与食品级蛋白酶，二者相差较小，饲料级蛋白酶略高于食品级蛋白酶，因此，选取组1饲料级蛋白酶进行谷朊粉酶解试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.014.T002表2两组不同蛋白酶水解谷朊粉多肽含量的测定结果项目组1组2多肽含量74.37±0.1774.11±0.26g/100 g2.2复合酶水解谷朊粉工艺优化结果2.2.1谷朊粉添加量对谷朊粉水解可溶性小肽含量的影响（见图1）由图1可知，随着谷朊粉添加量不断增加，可溶性小肽含量呈下降趋势。原因是底物添加量增大，谷朊粉在溶剂里成团情况严重，影响了谷朊粉与酶的反应面积、遮挡了酶切点位。由于体系中谷朊粉水平过大会造成体系中有效水分水平过低，从而导致谷朊粉和蛋白酶的扩散与运动速度缓慢，对水解过程造成了抑制作用，并且谷朊粉水平过大，生产成本增加，对经济效应产生不利影响。因此，优化时选择谷朊粉添加量为8%、10%、12%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.014.F001图1谷朊粉添加量对谷朊粉水解可溶性小肽含量的影响2.2.2pH值对谷朊粉水解可溶性小肽含量的影响（见图2）由图2可知，随着初始pH值升高，可溶性小肽含量呈先上升再下降的趋势，pH值为8时可溶性小肽的含量最高，不同pH值对蛋白酶水解的效果并不明显，但由于酶对pH值具有最适范围。因此，在优化时选择pH值7、8、9进行试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.014.F002图2pH值对谷朊粉水解可溶性小肽含量的影响2.2.3酶添加量对谷朊粉水解可溶性小肽含量的影响（见图3）由图3可知，蛋白酶添加量越大，可溶性小肽含量越高，添加7%蛋白酶可溶性小肽含量最大。由于酶添加量增大，加速了酶与底物谷朊粉的反应速率，但由酶反应理论可知，底物含量趋于稳定时，酶添加量越大，可溶性小肽含量增幅趋于稳定。从经济角度考虑，酶添加量会增加试验成本，并在日后产业化时会增加生产成本。因此，在条件优化时选择5%、6%、7%进行试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.014.F003图3酶添加量对谷朊粉水解可溶性小肽含量的影响2.2.4水解时间对谷朊粉水解可溶性小肽含量的影响（见图4）由图4可知，随着水解时间延长，可溶性小肽含量呈上升趋势。在2~3 h时，可溶性小肽含量较为平稳，说明在水解3 h后，随着水解时间延长，酶与物料水解效果更加充分，酶切效应更加明显，且蛋白质被水解成氨基酸，不利于小肽收集。因此，在优化中选择3、4、5 h进行试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.014.F004图4水解时间对谷朊粉水解可溶性小肽含量的影响2.2.5水解温度对谷朊粉水解可溶性小肽含量的影响（见图5）由图5可知，随着水解温度升高，可溶性小肽含量呈先上升再下降的趋势，50 ℃可溶性小肽含量最高。与刘媛等[15]研究一致，因此，判定中性蛋白酶与碱性蛋白酶的最适水解温度约为50 ℃，在正交试验中以50 ℃为标准进行试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.014.F005图5水解温度对谷朊粉水解可溶性小肽含量的影响2.3正交试验及方差分析结果（见表3、表4）由表3、表4可知，水解后短肽得率最高可达81.56%，组合为谷朊粉添加量10%、pH值7、酶添加量6%、水解时间5 h。由R值可知，影响水解谷朊粉短肽得率的因素排序为DCBA，最优组合为A3B1C2D3，即谷朊粉添加量12%、pH值7、酶添加量6%、水解5 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.014.T003表3正交试验结果项目ABCD多肽含量/(g/100 g)1875368.892886473.403897577.1141076581.5651087369.6761095471.0471277475.3981285576.2091296373.46k173.1375.2872.0470.67k274.0973.0976.1473.28k375.0273.8774.0678.29R1.892.194.107.62因素主次DCBA最佳组合A3B1C2D310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.014.T004表4正交试验方差分析项目Ⅲ型平方和自由度均方F值P值A15.90627.95378.7370.01B22.233211.117110.0570.01C75.365237.683373.0680.01D269.7572134.8791 335.3340.01误差1.818180.101修正后总计385.0826注：P0.01表示影响极显著。2.4水解谷朊粉最佳工艺参数验证结果（见表5）由表5可知，选用组1中的酶，选取12%的谷朊粉，设定水解温度50 ℃、pH值7、酶添加量6%、水解5 h，得到小麦低聚肽的多肽含量为84.34%，高于正交试验中最高的81.56%，表明优化结果可靠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.014.T005表5验证试验结果项目123平均值多肽含量84.5684.0284.4484.34g/100g2.5谷朊粉酶解液的分子量分布情况（见图6、表6）由图6可知，小麦低聚肽是小分子混合物，小麦低聚肽主要出峰时间在12~30 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.014.F006图6小麦低聚肽分子量分布的液相色谱图由表6可知，谷朊粉酶解液重均分子量为764 Da，主要出峰时间在21 min左右。因此，分子量小于1 000 Da的小麦低聚肽占比87.19%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.05.014.T006表6小麦低聚肽的分子量分布分子量范围/Da所占比例/%重均分子量/Da谷朊粉酶解液重均分子量764低于1405.902 985140~50059.980 6304500~1 00021.305 36791 000~5 0009.459 31 824高于5 0003.351 97 7583讨论近年来，饲料中添加生物类活性肽的功能性质和应用引起了人们广泛关注[16]。与蛋白质、氨基酸相比，低聚肽具有吸收快、转运速度迅速、能耗低、不易饱和等特点。而在饲料添加抗生素、化学合成药物、激素、β-兴奋剂、重金属、镇静剂等直接导致了畜牧业中药物残留严重，间接影响人体健康。在饲料中添加生物活性肽能够补充饲料中的营养成分，改善饲料适口性，并且还具有很多的功能性[17]，如增强免疫功能、提高动物生产性能、促进骨骼生长，丰富动物肠道菌群、调节动物体内微生态等。小麦低聚肽中含有丰富的谷氨酰胺肽。谷氨酰胺肽在维持肠道健康、提高动物生产性能等方面发挥巨大作用。在正常饲养情况下，畜禽机体内所合成的谷氨酰胺肽能够满足自身生长发育的需求，但当动物机体处于应激状态时，体内的谷氨酰胺无法满足新陈代谢的需求，所以在饲料中长期添加小麦低聚肽能够较好地补充动物体内的谷氨酰胺[18]。但游离的谷氨酰胺长期存在水溶性差、稳定性差、易降解等缺点，谷氨酰胺肽作为谷氨酰胺的稳定化替代品，不仅包含了谷氨酰胺的生理功能特性，还能够克服谷氨酰胺单体不稳定的缺点[19]。使用饲料级别的蛋白酶对谷朊粉进行酶解，不仅保留了小麦低聚肽的生理功能[20]，在理化指标与生物性质中保持了相同水准，而且大大缩减了生产成本。小麦低聚肽以其特定的功能特性应用于新型发酵饲料行业，因小麦产量大、成本低、安全性高、便于工业化生产等特点，将小麦低聚肽作为功能性基料，具有广阔的发展前景。与食品级别的蛋白酶相比，饲料级别的蛋白酶只有其成本的1/5，因此使用饲料级蛋白酶酶解出小麦低聚肽可以降低成本。4结论本试验发现，饲料级中性、碱性蛋白酶酶解谷朊粉的可溶性小肽含量为74.37 g/100 g；采用正交试验优化中性蛋白酶与碱性蛋白酶的水解条件，得出最优的工艺条件为谷朊粉添加量12%、pH值7、中性蛋白酶与碱性蛋白酶各添加3%、水解5 h，此条件下，可溶性小肽含量可达84.34%。采用高效液相色谱测出水解产物其重均分子量为764 Da，分子量小于1 000 Da的小麦低聚肽占比87.19%。