近年来，饲料蛋白原料紧缺，导致各类蛋白饲料原料价格上涨，制约了畜牧养殖业的发展[1]。蛋白质是动物饲料中重要的营养成分，也是动物代谢所必需的关键营养物质，提升日粮中蛋白质消化利用率有助于增强动物的生产性能，提高养殖的经济效益[2]。蛋白酶是具有催化、水解蛋白质类大分子物质的活性酶，广泛存在于生物体内[3]，在畜禽生产中具有较高的应用价值。有研究表明，日粮中添加外源蛋白酶可以影响猪的消化系统及体内其他器官的发育[4]。日粮中添加外源蛋白酶还可以改善家禽的生产性能、畜产品品质和营养物质消化利用率[5-7]。本试验研究日粮中添加不同水平外源蛋白酶对芦花鸡生长性能、屠宰性状、免疫器官指数、肉品质及肠道形态等多项指标的影响，为外源蛋白酶在芦花鸡生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料外源蛋白酶由四川华堂聚瑞生物科技有限公司生产，酶活力为1×106 U/g。本研究所使用的动物日粮由商品预混料与大宗原料混合制成。1.2试验设计选择46日龄、体重约为1 450 g的去势芦花鸡240只，随机分成4组，每组6个重复，每个重复10只肉鸡。A组（对照组）为标准蛋白日粮；B组为低蛋白日粮组，C组为低蛋白日粮+200 mg/kg外源蛋白酶，D组为低蛋白日粮+400 mg/kg外源蛋白酶。预试期3 d，试验期10周。低蛋白日粮组成及营养水平见表1。标准蛋白日粮组成及营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.009.T001表1低蛋白日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.0玉米53.0代谢能/(MJ/kg)12.24豆粕17.5粗蛋白质/%16.43棉籽粕2.5钙/%0.93花生粕2.5总磷/%0.65玉米蛋白粉5.5赖氨酸/%1.01DDGS12.0蛋氨酸+半胱氨酸/%0.83大豆油2.0预混料5.0注：1.预混料为5%肉大鸡复合预混合饲料，由北京升牧实润有限公司生产。2.营养水平中粗蛋白质、钙、磷为实测值，其他均为计算值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.009.T002表2标准蛋白日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.0玉米61.5代谢能/(MJ/kg)12.64豆粕31.5粗蛋白质/%17.78大豆油2.0钙/%0.925%预混料5.0总磷/%0.63赖氨酸/%1.08蛋氨酸+半胱氨酸/%0.871.3饲养管理试验在唐山市张金路珍禽养殖场进行。试验前对养殖场地进行全面消毒，待干燥后进行试验。试验期间，试验鸡饲喂方式为舍饲，芦花鸡每天饲喂2次（8：00、16：00），自由饮水。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能于试验开始与结束前12 h对试验鸡空腹称重。每日统计喂料量及余料量，记录芦花鸡死亡数，计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）、料重比（F/G）和存活率。ADG=(试验末重-试验初重)/试验天数(1)ADFI=全期采食量/试验天数(2)F/G=平均日采食量/平均日增重(3)1.4.2屠宰性能试验结束后，每个重复选择1只鸡称重，颈部放血致死，去毛并沥干水分后称量屠体重；分别称量全净膛重、半净膛重、腿肌重、腹脂重、胸肌重，计算屠宰率、全净膛率、半净膛率、腿肌率、腹脂率、胸肌率、法氏囊指数、胸腺指数和脾脏指数。屠宰率=屠体重/宰前活重×100%(4)全净膛率=全净膛重/宰前活重×100%(5)半净膛率=半净膛重/宰前活重×100%(6)腿肌率=腿肌重/全净膛重×100%(7)腹脂率=腹脂重/全净膛重×100%(8)胸肌率=胸肌重/全净膛重×100%(9)1.4.3免疫器官指数屠宰后收集芦花鸡法氏囊、胸腺和脾脏，将器官表面水分擦干，称取器官湿重，计算芦花鸡的免疫器官指数。法氏囊指数=法氏囊重/宰前活重×100%（10）胸腺指数=胸腺囊重/宰前活重×100%(11)脾脏指数=脾脏囊重/宰前活重×100%(12)1.4.4肉品质参考《畜禽肉质的测定》（NY/T 1333—2007）测定宰后45 min、24 h的pH值、滴水损失率、蒸煮损失率和肉色。参考《肉嫩度的测定剪切力测定法》（NY/T 1180—2006）测定剪切力。1.4.5肠道形态屠宰后，获取鸡十二指肠，剪取2 cm，使用生理盐水清洗肠道内食糜，将清洁后的肠道用4%多聚甲醛固定，保存24 h，采用Motic-BA210型显微镜观测隐窝深度（VH）、绒毛高度（CD），并计算绒毛高度与隐窝深度的比值（V/C）。1.4.6肠道屏障功能相关的基因表达屠宰后，剪取空肠前端2 cm，使用生理盐水清洗肠道黏膜，采用载玻片轻取洁净黏膜于冻存管，置于液氮中。使用TRIzol法提取黏膜样品的总RNA，质检合格进行反转录，qPCR定量。内参基因（β-actin）和目标基因PCR引物序列见表3。试剂盒购自艾博抗（上海）贸易有限公司。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.009.T003表3引物序列基因引物序列（5'→3'）长度/bpOCLNF：ACAGCCCTCAATACCAGGATGTGR：ACCATGCGCTTGATGTGGAA153ZO-1F：TATAGAAGATCGTGCGCCTCCR：GAGGTCTGCCATCGTAGCTC169MUC2F：TTCATGATGCCTGCTCTTGTGR：CCTGAGCCTTGGTACATTCTTGT142β-actinF：ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTR：ATTACCGCGGCCTGCTGGG1581.4.7经济效益统计试验期间单只肉鸡消耗的饲料成本和产肉价值，计算每只鸡在试验期间创造的养殖理论，以分析外源蛋白酶在芦花鸡养殖中的可行性，低蛋白日粮的价格为3.558元/kg，标准日粮价格3.653元/kg，外源蛋白酶价格80元/kg，散养芦花鸡销售价格约为60元/kg。饲料成本=试验期间采食量×饲料单价(13)蛋白酶使用成本=蛋白酶用量×蛋白酶价格(14)试验阶段增重价值=总增重×芦花鸡销售单价(15)养殖阶段利润=试验阶段增重价值-(试验阶段饲料成本+外源蛋白酶使用成本)(16)1.5数据统计与分析数据采用SPSS 26进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”或平均值表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1外源蛋白酶对鸡生长性能的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，B组芦花鸡试验末重显著下降（P0.05），C组和D组试验末重显著高于B组，但与对照组差异不显著（P0.05）。B组芦花鸡的平均日增重显著低于对照组（P0.05），C组和D组显著高于B组，B组芦花鸡料重比显著高于对照组（P0.05），D组的料重比显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.009.T004表4外源蛋白酶对芦花鸡生长性能的影响组别初重/(g/只)末重/(g/只)平均日增重/[g/(只·d)]平均日采食量/[g/(只·d)]料重比存活率/%A组1 478.92±33.702 868.42±60.37ab19.85±1.12a103.38±8.425.21±0.09b100B组1 467.38±23.482 625.18±48.76c16.54±0.89b101.27±9.466.12±0.16a100C组1 453.41±28.922 798.81±58.17b19.22±1.07a102.27±11.325.32±0.12b100D组1 455.68±26.342 936.88±67.25a21.16±1.52a103.39±8.194.89±0.07c100注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表5、表6、表8、表9与此同。2.2外源蛋白酶对芦花鸡屠宰性能的影响（见表5）由表5可知，C组、D组芦花鸡宰前活重与对照组差异不显著，但显著高于B组（P0.05）。与对照组相比，B组屠宰率显著降低（P0.05），C组、D组屠宰率与对照组差异不显著，但显著高于B组（P0.05）。B组芦花鸡半净膛率显著低于对照组、C组和D组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.009.T005表5外源蛋白酶对芦花鸡屠宰性能的影响组别宰前活重/g屠宰率/%全净膛率/%半净膛率/%腿肌率/%腹脂率/%胸肌率/%A组2 866.39±43.67ab90.84±1.01a67.32±1.5880.15±2.02a24.08±1.232.68±0.1318.49±1.53B组2 627.45±30.29c87.42±0.86b65.89±2.0176.43±1.93b23.89±0.982.67±0.0717.21±1.84C组2 796.42±35.88b90.67±1.13a67.08±1.9478.32±1.57ab24.10±1.072.71±0.1518.42±1.40D组2 926.96±34.73a91.32±1.30a67.94±1.3981.67±2.67a24.15±0.842.70±0.0818.53±1.672.3外源蛋白酶对芦花鸡免疫器官指数的影响（见表6）由表6可知，各组鸡的法氏囊指数和胸腺指数差异均不显著（P0.05）。B组芦花鸡脾脏指数均显著低于对照组、C组和D组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.009.T006表6外源蛋白酶对芦花鸡免疫器官指数的影响组别法氏囊指数胸腺指数脾脏指数A组0.20±0.020.18±0.020.19±0.04aB组0.19±0.030.16±0.020.11±0.03bC组0.19±0.020.17±0.020.20±0.03aD组0.20±0.030.19±0.030.21±0.03a%2.4外源蛋白酶对芦花鸡肉品质的影响（见表7）由表7可知，B组和C组芦花鸡的滴水损失率显著高于对照组（P0.05），D组滴水损失率显著低于对照组（P0.05），B组蒸煮损失率显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.009.T007表7外源蛋白酶对芦花鸡肉品质的影响项目A组B组C组D组pH45 min值6.42±0.066.43±0.086.38±0.066.45±0.07pH24 h值5.79±0.055.84±0.045.83±0.035.86±0.04滴水损失率/%2.89±0.09c3.27±0.15a3.18±0.14b2.93±0.10c蒸煮损失率/%15.28±0.68b16.87±0.72a15.16±0.60b15.15±0.48b剪切力/N62.35±4.1858.46±3.5759.24±3.3061.87±2.84L*44.85±3.9541.80±4.6743.56±±3.5146.17±4.22a*1.76±0.191.58±0.321.72±0.201.83±0.31b*14.21±1.5611.98±1.8313.58±2.3414.06±1.97注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.5外源蛋白酶对芦花鸡肠道组织形态的影响（见表8）由表8可知，B组芦花鸡的VH、CD和V/C显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.009.T008表8外源蛋白酶对芦花鸡十二指肠形态指标的影响组别VH/μmCD/μmV/CA组1 386.48±103.12a196.29±7.28a7.06±0.18aB组1 186.46±82.34b182.16±6.43b6.51±0.24bC组1 352.01±95.94a193.27±9.40ab7.00±0.22aD组1 451.83±123.57a206.88±10.67a7.02±0.17a2.6外源蛋白酶对芦花鸡肠道屏障相关基因表达的影响（见表9）由表9可知，B组芦花鸡MUC2基因的相对表达量显著低于对照组（P0.05），且D组MUC2基因的相对表达量显著高于其他各组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.009.T009表9外源蛋白酶对屏障功能相关基因表达的影响组别OCLNZO-1MUC2A组1.26±0.271.07±0.110.96±0.09bB组1.13±0.170.98±0.160.77±0.04cC组1.18±0.211.06±0.090.95±0.08bD组1.30±0.181.10±0.071.18±0.10a2.7外源蛋白酶对芦花鸡养殖经济效益的影响（见表10）由表10可知，各组饲料成本从高到低排序为A组、D组、C组、B组。C组和D组外源蛋白酶使用成本分别为0.11、0.23元/只，但总体的饲料成本仍然未超过对照组。各组芦花鸡试验阶段增重价值从高到低排序为D组、A组、C组、B组。综合养殖经济效益，D组的养殖利润比对照组高10.47%，而B组、C组分别比对照组利润低22.27%和3.14%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.009.T010表10外源蛋白酶对芦花鸡试验阶段养殖经济效益的影响项目A组B组C组D组饲料采食量/(g/只)7 236.607 088.907 158.907 237.30饲料成本/(元/只)26.4425.2225.4725.75外源蛋白酶用量/(mg/只)001 431.782 894.92外源蛋白酶使用成本/(元/只)000.110.23增重/(g/只)1 389.501 157.801 345.401 481.20增重价值/(元/只)83.3769.4780.7288.87利润/(元/只)56.9344.2555.1462.893讨论3.1外源蛋白酶对芦花鸡生长性能的影响研究表明，外源蛋白酶协同内源蛋白酶可以增加营养物质消化利用率，促进肉鸡生长[5,8-10]。李东东等[11]采用3×3双因素试验设计，设置3种粗蛋白水平和外源蛋白酶水平（0、150、300 mg/kg）对AA肉鸡进行饲养试验，结果表明，肉鸡试验末体重、ADG随着外源蛋白酶添加量的上升而显著上升，F/G显著下降，AA肉鸡日粮中外源蛋白酶的最适添加量为300 mg/kg。张运锋等[12]分别使用基础日粮、基础日粮+200 mg/kg蛋白酶、低蛋白日粮+200 mg/kg蛋白酶日粮饲喂岭南黄商品代肉雏鸡，结果表明，低蛋白日粮+200 mg/kg蛋白酶组肉鸡的ADFI在1~21 d显著高于基础日粮组和基础日粮+蛋白酶组，所有添加蛋白酶组的肉鸡F/G均显著低于基础日粮组。刘胜利等[13]在黄羽肉鸡日粮中分别添加100、200、400、800 mg/kg的外源蛋白酶，以基础日粮为对照组进行饲养试验，结果表明，外源蛋白酶能够显著降低黄羽肉鸡的F/G，且适宜添加量为200 mg/kg。本研究结果显示，外源蛋白酶可以提高芦花鸡的生产性能并与添加水平呈剂量效应。3.2外源蛋白酶对芦花鸡屠宰性能的影响屠宰性能是衡量动物健康状况和养殖效益的重要指标[14]。王秀梅等[15]在肉鸡低磷低蛋白日粮中添加植酸酶和蛋白酶，结果表明，外源蛋白酶可以使低磷低蛋白日粮组肉鸡的生产性能达到标准日粮的饲喂水平，各组肉鸡的半净膛率、屠宰率、全净膛率、胸肌率、腿肌率等指标均无显著影响。许啸等[16]分别对AA肉鸡饲喂玉米豆粕型日粮、玉米豆粕型日粮+150 mg/kg、高粱豆粕型日粮、高粱豆粕型日粮+150 mg/kg外源蛋白酶，结果表明，添加外源蛋白酶可以显著提高AA肉鸡胸肌重量。许程等[17]分别使用标准日粮、低蛋白日粮（粗蛋白含量为标准日粮的95%）+125 mg/kg蛋白酶饲喂肉鸭，结果表明，2组肉鸭的屠宰性能差异不显著，但肉鸭的生产性能明显提高。本试验中，添加外源蛋白酶可以提高芦花鸡屠宰率和半净膛率，原因可能是日粮中添加外源蛋白酶提高了芦花鸡蛋白质消化利用率，使更多的氨基酸用于蛋白质合成。3.3外源蛋白酶对芦花鸡免疫器官指数的影响胸腺、法氏囊和脾脏是家禽的主要免疫器官，其指数越高表明机体免疫性能越强[18]。侯振平等[19]分别在基础日粮中添加125 mg/kg PT125蛋白酶、100 mg/kg BFB蛋白酶，结果表明，不同类别蛋白酶对免疫器官指数无显著影响。李忠荣等[20]在肉鸡日粮中添加外源蛋白酶，结果表明，各组肉鸡的法氏囊指数和胸腺指数在42日龄时无显著差异，显著提高了肉鸡脾脏指数，与本试验结果相似。可能是由于饲料消化率提升，器官发育所需的营养物质更为充足，加快体内免疫器官的发育。3.4外源蛋白酶对芦花鸡肉质性状的影响提升肉品质可以增强芦花鸡产品的市场竞争力[21]。许啸等[16]发现，在日粮中添加蛋白酶，显著提高了肉鸡胸肌宰后pH24 h值，显著降低胸肌的滴水损失。郭正富等[22]在高粱代替玉米的肉鸡日粮中添加200 mg/kg外源蛋白酶，结果发现，肉鸡的ADG和胸肌重量明显提高，显著降低了胸肌滴水损失。本试验中，日粮中添加外源蛋白酶可以显著降低芦花鸡胸肌滴水损失，400 mg/kg时与标准蛋白日粮组无显著差异。因此，肉鸡日粮中添加外源蛋白酶可以改善肉鸡的肉品质，其作用机制需要进一步深入研究。3.5外源蛋白酶对芦花鸡肠道形态指标的影响肠道为动物机体最大的消化器官，VH、CD和V/C是评价肠道功能的重要生理指标[23]。许啸等[16]研究发现，日粮中添加150 mg/kg的蛋白酶可以显著提高AA肉鸡十二指肠、空肠及回肠的VH值，显著降低CD值。侯振平等[19]在肉鸡日粮中添加50、200、400 mg/kg的外源蛋白酶，可以显著提高回肠VH值，所有添加蛋白酶日粮组肉鸡CD值显著低于对照组，400 mg/kg组V/C显著高于对照组。本试验中，日粮中添加外源蛋白酶可以改善肠道形态指标，原因是日粮中添加外源蛋白酶可以提高蛋白消化利用率，减少蛋白异常发酵引起的肠炎等现象；蛋白酶还可以水解部分致敏或抗营养因子，减少组胺、毒素等[24]。3.6外源蛋白酶对芦花鸡肠道屏障基因表达的影响COLN和ZO-1在肠道中特异性表达并形成细胞外的屏障，可以有效抵抗病原微生物入侵，并且其表达量与肠道的通透性呈正相关[25]。MUC2是肠道黏膜中的主要黏蛋白，与肠道菌群附着有关，可以为特定的肠道微生物提供营养支持[26]。本研究中，日粮中添加蛋白酶可以促进MUC2基因的表达，蛋白酶主要侧重于改善肠道菌群的附着，可能是由于蛋白酶减少蛋白的异常发酵，病原微生物增殖受到抑制，进而影响该基因的表达。目前日粮中添加蛋白酶对鸡肠道相关基因的表达研究较少，还需要进一步深入探究。3.7外源蛋白酶对芦花鸡养殖经济效益的影响养殖经济效益是评价外源蛋白酶在芦花鸡养殖中可行性的重要指标。谭权等[27]在蛋鸡基础日粮中分别添加50、100、250 mg/kg外源蛋白酶，结果发现，日粮中添加250 mg/kg蛋白酶可以使10 000只蛋鸡每天产蛋收入增加82元。本研究中，添加200 mg/kg外源蛋白酶可以使饲喂低蛋白日粮的芦花鸡生产性能接近标准蛋白日粮组，养殖利润低于标准蛋白日粮组。当添加量为400 mg/kg时可使每只芦花鸡创造的养殖利润比标准蛋白日粮组芦花鸡高5.96元。4结论本研究结果表明，在低蛋白日粮中额外添加外源蛋白酶可以改善芦花鸡生长性能、屠宰性能、肉品质，能够提高芦花鸡免疫和消化功能。综合养殖经济效益，建议添加量为400 mg/kg。