氧气能够维持人和动物的生存，以电子受体的形式参与ATP的合成，并为生命活动供能[1]。缺氧表现为体内氧含量比正常低的一种特定的生理/病理条件。机体在接受外界低氧环境的刺激后，会产生一系列非特异性应答以适应环境，这类刺激反应即低氧应激。低氧应激会导致多种疾病，如糖尿病、癌症、心血管系统疾病以及免疫功能下降等，对人体产生不利影响，通常表现为呼吸频率降低、心率减慢、体温下降，甚至休克。哺乳动物细胞内许多生化反应均在充足氧气条件下才能够顺利进行[2]。机体长期处在低氧环境中可诱发一系列的生理/病理反应，使器官出现形态结构、代谢和机能上的异常；若机体无法适应强低氧应激，引起组织器官功能衰竭，特别是神经系统及心血管系统出现各种不易恢复的损害，最终导致脑、心脏等主要器官由于供能不足出现坏死现象[3]。因此，研究低氧应激状态具有重要意义。菊苣酸（CA）是咖啡酸的衍生物，分子式为C22H18O12，分子量为474.37，熔点206 ℃，针型结晶[4-5]。CA在抗氧化、抗菌、抗病毒、增强免疫力和抗炎方面均具有显著功效。CA可通过减少细胞中的活性氧（ROS）、脂质过氧化物丙二醛的积累以及清除自由基、抑制低密度脂蛋白（oxLDL）的氧化提高机体抗氧化功能。CA也在抗衰老和心血管保护方面具有药理作用。Schlernitzauer等[6]研究表明，CA可通过减少活性氧的积累、提高活性氧解毒酶的活性和表达以及激活AMPK途径发挥抗氧化损伤作用，提高其抗氧化活性。CA具有较强的清除DPPH自由基、·OH自由基、ABTS自由基的能力，其作用强度高于其降解产物咖啡酸和咖啡酒石酸。Wu等[7]研究表明，低氧环境下CA可促进牦牛心肌组织HIF-1α、EPO、VEGF等低氧适应基因的表达，增强高寒地区牦牛的低氧适应性。本课题组前期研究表明，低氧环境下CA可通过改善SD大鼠血液学指标，增强SD大鼠对高海拔低氧环境的适应能力[8]。目前关于CA对缺氧诱导的H9c2大鼠心肌细胞氧化应激、炎症因子和能量代谢影响的报道较少。本试验研究缺氧对H9c2心肌细胞抗氧化能力、炎症因子和能量代谢的影响，为CA开发成抗氧化饲料添加剂提供参考。1材料与方法1.1试验材料与仪器设备H9c2大鼠心肌细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。紫锥菊提取物-CA购自西安锐博生物科技有限公司，为黄绿色精细粉末，其中CA含量4％，咖啡酸1.0%~1.5%，绿原酸0.5%~1.0%，紫锥菊甙0.3%~0.5%。DMEM干粉和胎牛血清（Gibco公司），PBS（Hfart公司），胰蛋白酶溶液（Solarbio公司），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超微量Ca2+-ATP酶、超微量Na+K+-ATP酶、总蛋白（TP）试剂盒（南京建成生物工程研究所），大鼠血红素氧合酶-1（HO-1）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（江苏酶免实业有限公司），胰蛋白酶溶液（Solarbio公司），青霉素-链霉素混合液（武汉普诺赛生命科技有限公司），RIPI（强）裂解液（陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司）。超净工作台（江苏通净净化设备有限公司）、CO2细胞培养箱（NUAIRE公司）、MIC-101细胞低氧小室-细胞缺氧-细胞高氧富氧培养仓（杭州艾普仪器设备有限公司，高速低温离心机（Dynamica公司）、酶标仪（MuLTISKAN公司）。1.2紫锥菊提取物-CA的配制将紫锥菊提取物-CA溶解于DMEM培养基中，配置60 mg/L的紫锥菊提取物-CA使用，4 ℃冰箱避光保存。1.3试验设计按照前期筛选的CA最佳质量浓度60 mg/L，1％氧浓度诱导24 h。取处于对数生长期的H9c2细胞接种至96孔板上。试验细胞分为对照组（常氧组）、低氧组（1％氧浓度）、低氧（1％氧浓度）＋CA（60 mg/L）组，每组设3个重复。各组预处理24 h，使细胞贴壁，生长至合适的细胞密度，将对照组与常氧+CA组细胞放置CO2培养箱中24 h，将低氧组与低氧＋CA组细胞放置1％氧浓度低氧小室中，将低氧小室置于CO2培养箱中24 h，每组共培养48 h。氧浓度使用MIC-101细胞低氧小室-细胞缺氧-细胞高氧富氧培养仓控制氧浓度。1.4测定指标及方法H9c2大鼠心肌细胞经96孔板培养。96孔板每孔加入15 μL裂解液，使用微量移液器轻轻吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，使用显微镜观察细胞情况。参照南京建成生物工程研究所试剂盒测定GSH-Px、SOD、MDA、CAT、超微量Ca2+-ATP酶、超微量Na+K+-ATP酶活性，参照江苏酶免实业有限公司试剂盒测定HO-1、IL-6、TNF-α、IL-10含量。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel软件进行初步处理，SPSS 26软件进行单因素方差分析，Duncan's法多重比较，Origin pro 9.0软件进行绘图。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1紫锥菊提取物-CA对低氧诱导下的H9c2大鼠心肌细胞氧化损伤水平的影响（见表1）由表1可知，与对照组相比，低氧组、低氧+CA组细胞CAT、GSH-Px活性极显著降低（P0.01），MDA含量极显著升高（P0.01）；低氧组细胞SOD活性、HO-1含量显著降低（P0.05）。与低氧组相比，低氧＋CA组细胞SOD、GSH-Px活性极显著升高（P0.01），MDA含量极显著降低（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.015.T001表1紫锥菊提取物－CA对低氧诱导下的H9c2大鼠心肌细胞氧化损伤水平的影响组别CAT/(U/mg prot)SOD/(U/mg)GSH-Px/(U/mg prot)HO-1/(ng/L)MDA/(μmol/g prot)对照组170.002 3±13.872 0A7.617 0±0.514 0A479.060 2±13.455 2Aa508.430 0±8.704 7a13.587 0±1.130 0C低氧组40.148 1±8.893 7B0.101 3±0.058 5C92.694 4±3.169 2Bb485.796 7±7.066 2b46.787 4±1.865 3A低氧+CA组62.731 5±13.351 6BC7.476 1±0.274 9AB129.861 1±27.627 0Cc503.746 7±12.419 8ab32.898 6±1.387 7B注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2紫锥菊提取物-CA对低氧诱导下的H9c2大鼠心肌细胞炎性因子的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，低氧组、低氧＋CA组细胞TNF-α、IL-6含量极显著升高（P0.01），IL-10含量极显著降低（P0.01）。与低氧组相比，低氧＋CA组细胞TNF-α、IL-6含量极显著降低（P0.01），IL-10含量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.015.T002表2紫锥菊提取物－CA对低氧诱导下的H9c2大鼠心肌细胞炎性因子的影响组别TNF-α/(ng/L)IL-6/(U/mg)IL-10/(U/mg prot)对照组14.683 3±1.181 1C22.693 3±1.675 4C479.060 2±13.455 2Aa低氧组182.753 3±5.160 2A317.190 0±1.078 5B92.694 4±31.692 2BCc低氧+CA组82.580 0±3.264 6B106.826 7±2.285 1A129.861 1±27.627 0Cb2.3紫锥菊提取物-CA对低氧诱导下的H9c2大鼠心肌细胞能量代谢的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，低氧组、低氧＋CA组细胞Ca2+ATP酶、Na+K+-ATP酶活性极显著降低（P0.01）。与低氧组相比，低氧＋CA组细胞Ca2+ATP酶、Na+K+-ATP酶活性极显著升高（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.015.T003表3紫锥菊提取物－菊苣酸对低氧诱导下的H9c2大鼠心肌细胞能量代谢的影响组别Ca2+-ATP酶Na+K+-ATP酶对照组3.337 0±0.257 1A6.329 2±0.221 8A低氧组0.173 2±0.114 8C0.634 2±0.119 2C低氧+CA组1.612 2±0.354 8B1.403 4±0.238 7BU/mg prot3讨论3.1紫锥菊提取物－CA对低氧诱导下的H9c2大鼠心肌细胞氧化损伤水平的影响低氧引起的氧化还原能力过强是由于ROS生成过多和抗氧化系统受损所致[9]。机体抗氧化系统由酶促系统和非酶促系统组成。酶促系统包括SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶[10]，可清除体内过量ROS和由ROS产生的超氧阴离子自由基（O2-），减缓对机体的氧化损害[11-12]。非酶促系统主要包括MDA、GSH等氧化产物和其他非酶类抗氧化剂[13]。低压低氧诱导ROS在小鼠心脏中蓄积，过量的ROS通过攻击生物膜诱发脂质过氧化，导致心肌组织中MDA含量显著增加[14]。为保护细胞免受ROS的伤害，机体存在完善的内源性抗氧化防御体系，主要包括抗氧化酶和非酶抗氧化剂。SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶是抵御自由基损伤的第一道防线。SOD将超氧阴离子转化为过氧化氢，CAT和GSH-Px进一步将过氧化氢转化为水[15]。SOD、CAT、GSH-Px的活性和HO-1含量可直接反映细胞抗氧化程度，MDA含量可间接反映细胞过氧化损伤程度[9]。本试验结果表明，与对照组相比，低氧组细胞SOD、CAT、GSH-Px活性极显著降低，HO-1含量显著降低，MDA含量极显著升高。因此低氧诱导下，H9c2细胞的抗氧化能力降低。本试验中，与低氧组相比，低氧＋CA组细胞SOD活性极显著升高，GSH-Px活性显著升高，MDA含量极显著降低，表明低氧诱导下，H9c2大鼠心肌细胞的抗氧化酶活性降低，过氧化酶活性升高，造成细胞的氧化损伤，加入菊苣酸后通过将超氧阴离子转化为过氧化氢，进一步将过氧化氢转化为水，清除体内过量ROS和由ROS产生的超氧阴离子自由基，缓解H9c2大鼠心肌细胞过氧化程度，提高抗氧化酶水平，提高H9c2大鼠心肌细胞在低氧环境下的抗氧化能力，进而缓解低氧诱导下造成的氧化应激下的氧化损伤。3.2紫锥菊提取物－CA对低氧诱导下的H9c2大鼠心肌细胞炎性因子的影响低氧诱导下可令细胞产生氧化应激，进而造成氧化损伤，此时细胞会产生免疫应答，分泌大量炎症因子，如促炎因子TNF-α、IL-6及抑炎因子IL-10等。炎症是低氧诱发肺损伤的主要病症之一，IL-6和TNF-α是重要的炎症因子，可加剧炎症细胞的浸润和黏附，刺激巨噬细胞释放更多促炎因子[16]。IL-10和IL-4能够抑制炎症因子IL-6和TNF-α的合成与释放，从而起到抗炎作用[17]。本试验结果表明，与对照组相比，低氧组细胞TNF-α、IL-6含量极显著升高，IL-10含量极显著降低，表明在低氧诱导下可促使炎症的发生；与低氧组相比，低氧＋CA组细胞TNF-α、IL-6分泌极显著降低，IL-10分泌极显著升高，表明在低氧诱导引发氧化应激造成的氧化损伤后，分泌大量炎症因子TNF-α、IL-6，抑炎因子IL-10分泌量降低，抑制促炎因子IL-6和TNF-α的能力减弱，进而加剧炎症细胞的浸润和黏附；加入CA后，通过提高抑炎因子IL-10和IL-4的分泌，抑制促炎因子IL-6和TNF-α释放，减弱炎症反应发生，进而提高机体在低氧环境下抵抗炎症的能力，从而提高高原动物对低氧环境的免疫能力。3.3紫锥菊提取物-CA对低氧诱导下的H9c2大鼠心肌细胞能量代谢的影响减少代谢率和代谢需求是细胞应对低氧环境的关键步骤之一[18]，心肌缺氧过程中往往伴随能量代谢障碍[19]。Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶是生物膜上的重要蛋白酶，对维持心肌细胞信号传导和细胞膜内外离子平衡起到重要作用[20]。本研究发现，低压低氧导致小鼠心肌组织中Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活性下降，造成细胞内Na+、Ca2+积聚，K+、Mg2+流失，造成细胞内高钙、低钾血症。细胞内钙超载会加重线粒体损伤，破坏细胞膜结构，最终引起心肌细胞的能量缺乏，造成迟发性细胞死亡等[21]。本试验结果表明，与对照组相比，低氧组细胞Na+K+-ATP酶及Ca2+ATP酶活力极显著降低，与低氧组相比，低氧＋CA组细胞Na+K+-ATP酶及Ca2+ATP酶活力均极显著升高。结果表明，低氧诱导后，Na+K+-ATP酶及Ca2+ATP酶活力下降，能量代谢水平降低，代谢率减少，令心肌细胞产生能量代谢障碍；加入CA后，H9c2大鼠心肌细胞Na+/K+-ATP酶和Ca2+ATP酶的活性升高，维持H9c2大鼠心肌细胞的细胞膜内外离子平衡，使H9c2大鼠心肌细胞的能量代谢在低氧环境下明显改善，增加其在低氧环境下的能量代谢率，从而保护线粒体免受损伤，保护细胞膜结构，进而使心肌细胞在低氧环境下的能量代谢率维持在正常水平，提高动物对低氧的适应能力。4结论低氧诱导造成H9c2大鼠心肌细胞的氧化损伤，能够降低细胞的抗氧化能力，发生炎症反应及能量代谢失衡。加入CA后，通过增强抗氧化酶活性，提高抗炎因子的含量，降低促炎因子的含量，增加能量代谢酶的分泌，提高其抗氧化能力、减弱炎症反应、提高能量代谢率，进而提高H9c2大鼠心肌细胞在低氧环境造成的氧化损伤的生存能力。