抗生素具有缓解断奶仔猪腹泻和提高生长性能的优点，但长期使用会出现耐药性和残留问题，我国已经在饲料端全面禁抗。锌元素是动物机体必需的营养素，目前，高锌已被广泛应用于生猪饲料生产中，成为抗生素的替代物。给断奶仔猪饲喂高锌日粮能够减少仔猪腹泻，可提高日增重、免疫力[1-4]。有研究发现，长期添加超过畜禽机体所需要的锌，会造成畜禽机体锌中毒，导致大量锌随畜禽粪便排出而污染环境[5-6]。铜元素也是动物机体必需的营养素，动物日粮中维持适宜水平的铜可以提高其生长性能[7]。有研究表明，高剂量锌可以降低铜的吸收[8-9]。由于铜锌的互作效应，仅考虑一种微量元素的适宜添加水平，容易造成另一种微量元素的利用率降低[10]。因此寻求一种既能保证动物的生长效果又能替代高锌和抗生素日粮的优化应用方案成为关注的热点。本试验选用的铜锌交联物质具有生物利用率高、添加量低、使用安全的优点[11-12]。木质素多酚是一类水解木质纤维素产生的苯丙烷类植物多酚，对动物肠道具有特殊的收敛抗腹泻作用，在提高生长性能以及调节免疫方面具有较好的效果[13-15]。研究发现，多酚类化合物与必需微量元素存在相互作用，能够对机体产生生物活性效应[16]。目前，有关木质素多酚与铜、锌联合应用的研究报道极少。因此，本试验拟研究联合添加木质素多酚与铜锌交联物质对断奶仔猪生长性能、免疫力以及铜锌沉积的影响，旨在为猪生产中探寻高锌和抗生素日粮替代方案提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验用木质素多酚（多酚含量≥85%）和铜锌交联物质（铜含量为17%，锌含量为15%）均由上海梵蓝国际贸易有限公司提供。1.2试验设计选取体重相近、健康状况良好的“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪96头，随机分成3组，每组4个重复，每个重复8头猪。对照组仔猪饲喂基础日粮+2 kg/t氧化锌+100 g/t金霉素+40 g/t黏杆菌素，T1组仔猪饲喂基础日粮+1 kg/t木质素多酚+700 g/t铜锌交联物质，T2组仔猪饲喂基础日粮+2 kg/t木质素多酚+700 g/t铜锌交联物质。试验基础日粮参考NRC（2012）仔猪饲养标准配制。基础日粮组成及营养水平见表1，试验日粮中铜、锌含量实测值见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.08.006.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米29.50消化能/(MJ/kg)14.43小麦次粉10.00干物质/%91.48膨化玉米20.00粗蛋白质/%17.6446%豆粕12.20粗脂肪/%6.24膨化大豆5.00粗纤维/%3.36发酵豆粕5.00粗灰分/%5.08鱼粉1.50钙/%0.83葡萄糖3.00有效磷/%0.38蔗糖2.00可消化赖氨酸/%1.26低蛋白乳清粉5.00可消化蛋氨酸/%0.39石粉1.00可消化含硫氨基酸/%0.68磷酸氢钙1.20可消化苏氨酸/%0.82氯化钠0.30可消化色氨酸/%0.25大豆油1.5098%赖氨酸0.65蛋氨酸0.15苏氨酸0.30色氨酸0.10一水柠檬酸1.00氯化胆碱（50%）0.10预混料0.50注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 7 000 IU、VD 3 300 IU、VE 60 IU、VK 3.0 mg、核黄素6.2 mg、VB6 3 mg、烟酸60 mg、VB12 0.03 mg、生物素0.46 mg、D-泛酸18.0 mg、Fe 110 mg、Cu 12 mg、Se 0.30 mg、Mn 10 mg、I 0.35 mg、Zn 75 mg。2.营养水平中干物质、粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维和粗灰分均为实测值，其余均为计算值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.08.006.T002表2试验日粮中铜、锌含量实测值组别铜锌对照组30.931 806.94T1组114.27230.53T2组124.31258.12mg/kg1.3饲养管理试验在辽宁沈阳博睿农牧科技有限公司科研猪场进行。选用全进全出饲养模式，试验前对猪舍和笼具进行清理和消毒，猪舍温度为（25±3）℃，湿度控制在60%~70%。仔猪每天喂料3次，自由采食和饮水。按猪场常规免疫消毒程序进行免疫和消毒。预试期7 d，正式试验期28 d，每天观察仔猪采食和健康状态并记录。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能正式试验期前对各组仔猪进行称重，于第28 d对仔猪空腹称重，统计试验期间各阶段试验动物采食量，计算各阶段的平均日增重、平均日采食量和料重比。每天以重复为单位观察记录每头仔猪腹泻的情况，观察粪便性状，计算腹泻频率。平均日增重=(终末体重-初始体重)/试验天数(1)平均日采食量=总采食量/(试验猪总数×试验天数)(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)腹泻频率=腹泻猪头数/猪总头数×100%(4)1.4.2血清生化指标正式试验期第28 d早晨，每个重复随机选择1头仔猪，空腹状态下前腔静脉采血，采集5 mL血液放入采血管，于室温下3 000 r/min离心15 min，分离血清，于-20 ℃冰箱保存。采用ELISA试剂盒（北京博锐长远科技有限公司）测定血清中炎症因子、免疫指标和肠道通透性指标，包括干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素10（IL-10）、补体3（C3）、补体4（C4）、D-乳酸（DLA）和二胺氧化酶（DAO）。1.4.3铜、锌含量试验结束前3 d，每个重复分别于早晚各收取约200 g新鲜粪便，混匀，于65 ℃烘72 h，室温回潮24 h，粉碎至40目，用于测定铜、锌含量。试验结束时，每个重复随机选择1头平均体重的健康仔猪采血，屠宰，采集背最长肌、肝脏、脾脏和肾脏组织于-20 ℃冰箱保存，冻干后用于测定组织铜、锌沉积量。参考NY/T 3318—2018标准，准确称取2~5 g组织放入坩埚中，加热炭化至无烟后，转入550 ℃高温炉中灰化，直至样品变成灰白色，加2 mL的超纯水和10 mL 50％硝酸溶液溶解蒸干，采用5 mL 50％的硝酸溶液加热溶解残渣，转移至50 mL容量瓶冷却定容，过滤，采用Agilent Technologies-200-seriesAA火焰原子吸收仪测定组织中锌、铜含量。1.5数据统计与分析试验数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1木质素多酚与铜锌交联物质联合添加对仔猪生长性能的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，T2组仔猪平均日采食量和平均日增重均略有提高（P0.05），T1组仔猪平均日采食量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.08.006.T003表3木质素多酚与铜锌交联物质联合添加对仔猪生长性能的影响项目初重/(kg/头)末重/(kg/头)平均日增重/[(g/(头·d)]平均日采食量/[(g/(头·d)]料重比腹泻率/%P值0.970.580.960.010.980.71对照组11.25±0.2817.00±0.89238.00±36.70484.10±5.87a2.13±0.328.78±0.53T1组11.32±0.4917.88±1.02227.00±42.30448.41±6.70b2.24±0.5010.64±0.87T2组11.32±0.2218.55±1.13241.00±25.20501.87±8.55a2.18±0.2010.32±0.71注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同写字母或无字母表示差异不显著（P0.05），下表同。2.2木质素多酚与铜锌交联物质联合添加对仔猪血清生化指标的影响（见表4）由表4可知，木质素多酚与铜锌交联物质联合添加使仔猪血清中IFN-γ含量降低，T1组仔猪血清中IFN-γ含量显著低于对照组（P0.05）。与对照组和T1组相比，T2组仔猪血清的补体C4含量升高，且显著高于T1组（P0.05）。T2组仔猪血清中DLA含量最低，比对照组降低18.82%（P0.05），比T1组降低35.55%（P0.05）。T2组仔猪血清中IL-6含量低于对照组和T1组，比对照组降低了11.29%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.08.006.T004表4木质素多酚与铜锌交联物质联合添加对仔猪血清生化指标的影响项目IFN-γ/(ng/L)IL-1β/(μg/L)IL-6/(ng/L)IL-10/(ng/L)C3/(nmol/L)C4/(ng/L)DLA/(ng/L)DAO/(ng/L)P值0.020.200.100.710.660.020.010.36对照组245.00±10.74a526.65±35.81727.34±67.11503.42±26.9075.38±1.86257.76±6.04ab67.55±3.10b22.24±3.79T1组146.68±10.79b494.94±22.20837.44±45.80513.82±53.6279.85±3.63221.11±17.20b85.09±2.59a28.69±3.20T2组202.91±36.26a574.35±27.23645.25±32.94466.96±40.3176.91±4.41282.29±10.83a54.84±5.17b22.96±2.862.3木质素多酚与铜锌交联物质联合添加对仔猪血清和粪便中铜锌含量的影响（见表5）由表5可知，T1组和T2组仔猪的血清和粪便中锌含量均显著低于对照组（P0.05）。添加了外源铜的T1组和T2组仔猪粪便中铜含量高于未添加外源铜的对照组，但差异未达到显著水平（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.08.006.T005表5木质素多酚与铜锌交联物质联合添加对仔猪血清、粪便铜锌含量的影响项目血清/(mg/L)粪便/(mg/kg)铜锌铜锌P值0.870.010.180.01对照组1.72±0.302.71±0.21a106.82±36.738 918.03±14.47aT1组1.88±0.260.63±0.05b172.80±46.511 158.57±16.72bT2组1.88±0.030.78±0.16b290.01±87.771 258.49±79.89b2.4木质素多酚与铜锌交联物质联合添加对仔猪组织铜沉积的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，T1组、T2组仔猪背最长肌、肝脏、脾脏和肾脏中铜沉积量均显著不差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.08.006.T006表6木质素多酚与铜锌交联物质联合添加对仔猪组织铜沉积的影响项目背最长肌肝脏脾脏肾脏P值0.820.470.840.56对照组0.56±0.223.44±1.271.09±0.492.65±1.12T1组0.44±0.085.16±1.440.86±0.291.81±0.44T2组0.48±0.073.16±0.771.13±0.163.61±1.76mg/kg2.5木质素多酚与铜锌交联物质联合添加对仔猪组织锌沉积的影响（见表7）由表7可知，各组间仔猪背最长肌、肝脏、脾脏和肾脏中锌的沉积量差异不显著（P0.05），但T1组、T2组仔猪肝脏中锌沉积量分别比对照组降低了42.74%和36.52%，脾脏中锌沉积量分别比对照组降低了51.80%和40.02%；T2组仔猪肾脏中锌沉积量比对照组降低了18.16%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.08.006.T007表7木质素多酚与铜锌交联物质联合添加对仔猪组织锌沉积的影响项目背最长肌肝脏脾脏肾脏P值0.590.120.150.19对照组37.15±6.33417.29±74.81191.27±45.71163.94±19.83T1组47.47±6.98238.92±23.6892.20±15.52290.46±88.32T2组46.41±7.35264.89±70.17114.72±5.28134.17±45.01mg/kg3讨论3.1木质素多酚与铜锌交联物质联合添加对仔猪生长性能的影响仔猪在断奶时胃肠道尚未完全发育，面临环境、营养、心理上的改变，加之日粮由液体变为了固体，均易影响机体对营养物质的消化吸收，造成断奶应激性腹泻，从而影响仔猪的生长发育。近年来，使用高锌日粮缓解仔猪腹泻的饲养方案得到了广泛应用，但是若锌的使用量超过机体需求量，可能会对仔猪生长性能产生不利的影响。铜锌交联产品具有抗菌和维持肠道黏膜完整性的作用，并且具备安全、生物利用率高、添加剂量低等显著特点。木质素多酚因具有抗氧化、促生长、抗炎、抗菌等生物活性而备受关注。Milani等[17]研究发现，日粮添加纳米氧化锌可以在一定程度上改善断奶仔猪的生长性能。吕芳等[18]研究表明，日粮添加0.02%茶多酚可显著提高育肥牛平均日增重，降低料重比。晁娅梅等[19]研究发现，日粮中添加400 mg/kg的茶多酚，能够显著改善育肥猪的平均日增重和净增重。孙廷等[20]研究表明，日粮中添加400 mg/kg植物多酚可以提高育肥猪的日增重和饲料效率，改善肌肉品质。王俊奎等[21]研究发现，实际饲料摄入量和预测饲料摄入量的差值及剩余采食量（RFI）越低，个体饲料消耗越少，对动物的生长速度无影响，但饲料使用的净效率越高。本试验中，与对照组相比，T1组仔猪日采食量显著降低，T2组仔猪平均日采食量和平均日增重均略有提高，但T1组和T2组仔猪的饲料报酬均与对照组持平，与前人研究结果相近。本试验中，T1组仔猪采食量低的原因可能是与对照组相比，T1组仔猪腹泻率升高，影响了仔猪采食量；随着T2组木质素多酚添加量的增加，由于木质素多酚具有收敛的作用，使T2组仔猪比T1组仔猪腹泻率降低，采食量升高。仔猪末重和日增重提高的原因可能一方面是铜锌交联物质更容易穿过肠道等生物屏障，提高饲料转化率[17]；另一方面木质素多酚含有大量咖啡因和多种维生素，具有兴奋神经中枢、促进新陈代谢等作用[19]，从而改善仔猪生长性能。在本试验中，添加高剂量木质素多酚和铜锌交联物质的试验组仔猪生长性能与添加高锌和抗生素的对照组生长性能更接近。3.2木质素多酚与铜锌交联物质联合添加对仔猪血清生化指标的影响炎症是机体对刺激的一种防御反应，许多细胞因子参与炎症反应应答，促炎和抗炎因子在多种炎症反应中起重要作用。血液是动物机体内环境稳定的重要因素，检测血液免疫指标可在一定程度上反映动物的机体代谢、营养状况及病理变化等状况。Jarosz等[22]研究发现，甘氨酸铜螯合物会增加家禽中免疫球蛋白、补体成分补体C3、补体C4含量以及溶菌酶活性。Song等[23]研究发现，添加载铜蒙脱石能够显著降低仔猪血清DAO活性及DLA含量。Maywald等[24]研究发现，高剂量锌会抑制机体的免疫功能，适量锌会抑制机体IL-6过度产生，上调细胞因子IFN-γ含量。IFN-γ是由特定免疫细胞分泌的一类高活性多功能糖蛋白。高倩囡[25]研究发现，桑叶醇提物对于罗非鱼的IFN-γ水平具有显著促进作用。张义[26]发现，鸡在正常情况下，机体内干扰素有一定量储备，当机体遇到外来病原体感染的时候，会迅速动用这部分储备，而中低剂量中药的作用下，这种动用机体干扰素的能力会增强，因此中低剂量组血清中干扰素含量会远低于攻毒对照组干扰素含量。卢亚飞等[27]研究发现，日粮添加天然植物提取物能够显著降低断奶仔猪血清中DLA含量。赵家奇等[28]研究发现，在断奶仔猪日粮中添加葡萄籽原花青素可以显著提高仔猪血清免疫球蛋白和补体含量。本试验中，与对照组相比，T1组仔猪血清中的干IFN-γ含量显著降低，T2组血清中的IFN-γ和DLA含量均有降低趋势；日粮添加高剂量木质素多酚组的仔猪血清补体C4含量较低剂量木质素多酚组显著升高；T2组血清中IL-6含量低于对照组和T1组，与上述研究结果一致。可能是因为木质素多酚联合铜锌交联物质兼具了木质素多酚和铜锌交联物质二者的优点，低剂量木质素多酚会提高动用机体干扰素的能力[26]，使血清中IFN-γ含量降低；而高剂量木质素多酚可能会抑制动用机体干扰素的能力，从而导致T2组IFN-γ含量较T1组有所升高。木质素多酚联合铜锌交联物质通过对仔猪肠道的保护和修复作用，维持肠壁的正常形态，从而减少DLA进入血液的含量[27]，通过下调补体抑制蛋白簇，从而提高应激状态下血清补体C4补体的含量[29]。因此，日粮中联合添加木质素多酚与铜锌交联物质，可以通过降低血清中IFN-γ、IL-6和DLA含量，提高补体C4含量，从而改善免疫机能。3.3木质素多酚与铜锌交联物质联合添加对仔猪铜锌沉积的影响猪主要通过吸收和排泄调节体内锌含量的稳定，血清中的锌含量可以反映机体锌的营养水平以及锌的利用率。肝脏是机体最大的存储铜的器官，铜在猪体内的利用率极低，大部分沉积在肝脏，其次是肾脏。毋囡囡等[16]研究发现，多酚易与高电荷密度的阳离子（如铜、锌）产生螯合作用，形成多酚-金属离子复合物，多酚通过影响必需微量元素稳态间接产生生物活性，引起健康促进效应。芦春莲等[30]研究表明，在生长猪日粮中添加低剂量聚天门冬氨酸锌替代高剂量硫酸锌，即可满足该阶段猪的生长需要，又能够显著降低粪中锌的含量。Creech等[31]研究发现，在日粮中降低锌的添加量可以降低粪便中锌的含量。秦士贞等[32]研究表明，提高肉鸡日粮中的锌水平，能够提高血液和肝脏中的铜锌含量以及胸肌中的铜含量。在本试验中，试验组日粮与对照组日粮相比锌含量低铜含量高，联合添加木质素多酚与铜锌交联物质的试验组仔猪血清和粪中锌含量均显著低于添加了高锌的对照组，肝脏中锌含量也降低；对照组日粮中的铜含量最低，但该组仔猪的血清、肌肉、脾脏和肾脏中铜含量与试验组接近，这与前人研究结果相近。可能一方面是由于多酚与锌的螯合作用，而形成多酚-金属离子复合物，从而导致锌含量降低。铜与锌在竞争蛋白质的结合位点，阻碍锌的沉积，随着铜含量升高，锌含量随之降低[33]。另一方面，添加木质素多酚与铜锌交联物质组仔猪饲料中锌含量明显降低，而且木质素多酚提高了对锌的吸收，使粪便中锌含量降低。结果表明，与添加高剂量氧化锌和抗生素的对照组相比，日粮中添加木质素多酚和铜锌交联物质能在保持断奶仔猪正常生长性能的前提下，显著提高仔猪对锌的利用率，降低锌的排放量，减少对环境的污染。4结论本研究发现，日粮中添加高剂量的木质素多酚与铜锌交联物质替代高锌与抗生素组合，可以在一定程度上提高断奶仔猪日增重，并通过降低血清中IFN-γ、IL-6和DLA含量，提高补体C4含量来改善免疫机能，有效降低粪便中锌的排泄量，且不会影响断奶仔猪的腹泻率；在断奶仔猪日粮中联合添加2 kg/t木质素多酚和700 g/t铜锌交联物质，能够替代高锌与抗生素组合的应用效果。