南美白对虾（Litopenaeus vannamei）又名凡纳滨对虾，具有生长周期短、环境适应性强、营养价值高等优势，深受消费者的喜爱[1]。随着水产养殖规模壮大和养殖密度增加，南美白对虾疾病的发生率增加。但使用抗生素预防疾病，会造成细菌耐药性、药物残留和水污染等问题，影响对虾的质量和食用安全[2]。因此寻找绿色安全的抗生素替代品成为目前水产行业亟待解决的问题。药用植物富含多种活性成分和营养成分，具有天然、高效、价廉、无毒（或低毒）、对养殖动物和环境副作用小等优点，且较少产生耐药性[3-6]。添加药用植物的有效成分能够增加动物食欲，促进机体新陈代谢和生长，可作为诱食剂或生长促进剂[7-8]；提高动物机体免疫力[9-10]，有效防控各类疫病病原，可作为抗菌剂、抗病毒药物和免疫增强剂[11-12]。猪毛蒿为菊科艾属植物，含有大量的多酚类、黄酮类、香豆素类、有机酸类等抗氧化、抗炎、抗菌类物质[13-14]，还含有蛋白质、氨基酸和大量的矿物质元素。猪毛蒿以全草入药，单独使用具有清热利湿、退黄等功效，为治疗黄疸之主药，具有利肝护胆作用。猪毛蒿水提物对鱼类具有保肝作用[15-17]，但其对甲壳动物的作用尚未见报道。本试验旨在分析饵料添加猪毛蒿粉对南美白对虾的生长性能、抗氧化能力和免疫力的影响，为猪毛蒿在南美白对虾养殖中的合理使用提供参考。1材料与方法1.1试验材料猪毛蒿购自唐山唐人医药有限公司，洗净，烘干，切割，粉碎，制成细度为300目以上（颗粒≤50 μm）的猪毛蒿粉。将称量好的猪毛蒿粉加入适量蒸馏水中，充分搅拌均匀至黏稠状态，倒入对虾基础饵料中，搅拌混匀，倒在干净塑料纸上，置于干燥通风处1~2 d充分晾干。1.2猪毛蒿粉对南美白对虾急性毒性试验采用常规生物急性毒性试验法研究猪毛蒿粉对南美白对虾96 h的半致死添加量，分别设置添加0、25、50、100、200、400 g/kg的猪毛蒿粉处理组。选取健康且体长均一的对虾幼虾饲养，每个养殖箱10只，每组3个重复。养殖箱每日换水，吸污，室内温度为（18±3）℃。每天记录死亡虾的数量，及时捞出死亡个体。试验结束，采用Excel 2019和SPSS 26.0软件对数据进行分析，使用直线内插法计算半致死添加量（LC50）。以添加量的对数为横坐标、死亡率的概率为纵坐标，在SPSS 26.0软件中获取线性回归方程。1.3南美白对虾的饲养试验1.3.1试验设计选取健康、平均体长为2.5 cm的南美白对虾2 100尾，随机分为7组，每组3个重复，每个重复100尾。空白对照组（A组）对虾饲喂基础饵料，阳性对照组（B组）对虾饲喂基础饵料，并向水中抛撒5 mL/L五黄精华液（内蒙古华天制药有限公司），试验组对虾在基础饵料中分别添加0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、8.0%猪毛蒿粉。基础饵料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.011.T001表1基础饵料组成及营养水平（风干基础）原料组成含量营养水平合计100.00鱼粉15.00粗脂肪6.80面粉23.00粗蛋白质38.20豆粕15.00钙1.95玉米蛋白粉8.00总磷1.28花生粕10.00虾壳粉6.00啤酒酵母6.00碳酸二氢钙1.50胆碱0.05维生素C0.03大豆油1.50鱼油1.50磷脂1.50微晶纤维素10.22预混料0.70注：1.预混料为每千克饵料提供：CuSO4 25.40 mg、KIO4 0.06 mg、CoCl2 4.44 mg、FeC6H5O7 27.42 mg、ZnSO4 31.76 mg、Ca3(PO4)2 160 mg、MgSO4 23.17 mg、MnSO4 0.13 mg、Na2SeO3 4 mg、VA 33 333 IU、VB1 25.5 mg、VD 4 800 IU、VE 99 IU、VK 10 mg、VB6 50 mg、泛酸钙61 mg、VB2 25 mg、叶酸6.25 mg、氰钴胺素0.1 mg、烟酸201 mg、肌醇800 mg、生物素2.5 mg、纤维素589.60 mg。2.营养水平均为实测值。%1.3.2饲养管理养殖试验在唐山市锦鸿水产育苗场内进行，采用养殖箱（长50 cm×宽40 cm×高40 cm）进行养殖。水体深度约25 cm，温度28~33 ℃，氨氮含量0.02~0.04 mg/L，亚硝酸盐含量0.02~0.04 mg/L，pH值7.8~8.5，溶氧量在6.0 mg/L以上，盐度15‰~18‰，整个饲养期间保持水质稳定。每2周称重1次，用以矫正投饵率，每天投喂4次，日投饵量为虾总重的5%~8%。每次投喂40 min后利用虹吸管收集残饵，经烘箱70 ℃烘干，记录投喂量和残饵量。试验期42 d。1.3.3测定指标及方法1.3.3.1生长性能在试验开始前，对每个养殖箱对虾进行计数、称重。试验最后1 d，对虾禁食24 h，计算每个养殖箱对虾的尾数，称重，计算对虾存活率（SR）、增重率（WGR）、特定生长率（SGR）和饵料系数（FCR）；每组随机抽取30尾对虾，测量体长和虾体重量，剖取肝胰腺后称重，计算肥满度（CF）和肝体比（HIS）。SR=终末尾数/初始尾数×100%(1)WGR=(末重-初重)/初重×100%(2)CF=体重/体长3×100%(3)HIS=肝重/体重×100%(4)SGR=(ln末重－ln初重)/试验时间×100%(5)FCR=每缸投喂饵料总量/每缸对虾总增重量(6)1.3.3.2养殖水体中氨氮、亚硝酸盐含量及pH值检测试验42 d，早晚检测养殖水体氨氮、亚硝酸盐含量及pH值。早晚取各组养殖水体水样，水样过滤后，滤液使用全自动间断化学分析仪CleverChem 200检测，参照《渔业水质标准》（GB 11607—1989）测定氨氮、亚硝氮和硝氮含量，使用便捷式pH计测定养殖水体pH值。1.3.3.3肝胰腺病理形态学分析试验结束后，南美白对虾禁食24 h，每个重复随机取5尾对虾解剖，剖取的肝胰腺组织经生理盐水漂洗，使用4%多聚甲醛固定，脱水，透明，浸蜡，包埋，切成厚度为4 μm的薄片，进行HE染色，使用中性树胶封片，光镜下观察组织学特征，其余肝胰腺组织于-80 ℃储存。1.3.3.4肝胰腺抗氧化指标取-80 ℃储存的肝胰腺组织块，在冰冷的生理盐水中漂洗，滤纸吸干水分后转移至EP管内，使用移液管量取预冷生理盐水，使用眼科剪将组织块剪碎后使用匀浆器在冰上研磨，制成10%的组织匀浆。根据试剂盒（南京建成生物工程有限公司）说明书检测南美白对虾肝胰腺中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和多酚氧化酶（PPO）活性。1.3.3.5肝胰腺免疫相关基因表达取-80 ℃储存的肝胰腺组织100 mg研磨，利用Trizol试剂提取RNA，使用Nardrop 2000/2000C超微量分光光度计检测RNA纯度和浓度。根据Promega GoScript™ Reverse Transcription System试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，使用qTOWER3 touch荧光定量基因扩增仪，根据Promega GoTaq® qPCR Master Mix试剂盒说明书，以β-actin为内参，对各组样品的目的基因cDNA进行定量测定。引物序列见表2。采用2-ΔΔCt计算法对各组样品测得的数据进行相对定量分析。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.011.T002表2引物序列基因上游引物（5'→3'）下游引物（5'→3'）长度/bpToll-1TCGACCATCCCTTTTACACCTTGCCTGGAAGGTCTGATTC20Toll-2CATGCCTGCAGGACTGTTTAGGCCTGAGGGT AAGGTCTTC20β-actinCGCGACCTCACAGACTACCTCTCGTAGGACTTCTCCAGCG201.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1南美白对虾的急性毒性试验结果（见表3）由表3可知，猪毛蒿粉对南美白对虾的24、48、72、96 h的LC50分别为2.57×107、6.76×106、3.80×105、1.58×105 g/kg，表明猪毛蒿粉的毒性较低，正式试验组所选取的添加量安全无毒。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.011.T003表3南美白对虾的急性毒性试验结果试验时间/h回归方程R²LC50/(g/kg)24y=0.068 7x-0.009 00.957 12.57×10748y=0.069 8x+0.023 30.946 36.76×10672y=0.086 2x+0.019 20.918 73.80×10596y=0.082 4x+0.071 40.677 31.58×105注：y和x分别为概率单位和质量浓度的常用对数。2.2猪毛蒿粉对南美白对虾生长性能的影响（见表4）由表4可知，与A组相比，各组对虾SR、WGR、CF、HIS、SGR均显著升高（P0.05），FCR显著降低，（P0.05）；与B组相比，各猪毛蒿粉添加组对虾的WGR、SGR均显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.011.T004表4猪毛蒿粉对南美白对虾生长性能的影响组别SR/%WGR/%CF/%HIS/%SGR/(%/d)FCRA组61.47±4.01b51.72±2.29c0.78±0.04b5.40±0.15b0.99±0.04c0.92±0.31bB组73.25±2.35a62.65±1.86b0.90±0.02a6.13±0.09a1.16±0.03b0.74±0.03a0.5%组72.75±2.72a87.57±2.42a0.86±0.02a6.19±0.11a1.50±0.03a0.76±0.24a1.0%组74.83±3.54a103.73±2.07a0.81±0.02a6.26±0.29a1.69±0.03a0.82±0.03a2.0%组75.58±3.16a103.60±1.78a0.82±0.02a6.46±0.09a1.69±0.02a0.78±0.06a4.0%组72.50±1.08a102.61±1.49a0.83±0.02a6.12±0.21a1.68±0.02a0.77±0.03a8.0%组73.25±0.65a77.48±1.59a0.82±0.02a5.97±0.14a1.37±0.02a0.78±0.02a注：同列数据肩标相同字母表示差异不显著（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05）；下表同。2.3猪毛蒿粉对南美白对虾养殖水体中氨氮含量、亚硝酸盐含量和pH值的影响（见表5）由表5可知，与A组相比，除0.5%组外，各组养殖水体中氨氮含量均显著降低（P0.05），除B组外各组养殖水体环境中亚硝酸盐含量均显著降低（P0.05），各组养殖水体环境pH值均显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.011.T005表5猪毛蒿粉对南美白对虾养殖水体中氨氮含量、亚硝酸盐含量和pH值的影响组别氨氮/(mg/L)亚硝酸盐/(mg/L)pH值A组0.56±0.17a0.26±0.04a9.64±0.55aB组0.36±0.17b0.23±0.04ab8.72±0.36b0.5%组0.40±0.14ab0.20±0.05b8.36±0.17b1.0%组0.35±0.09b0.19±0.04b8.40±0.14b2.0%组0.31±0.10b0.18±0.04b8.32±0.11b4.0%组0.32±0.11b0.19±0.04b8.36±0.17b8.0%组0.28±0.11b0.18±0.04b8.40±0.14b2.4猪毛蒿粉对南美白对虾肝胰腺组织形态的影响（见图1）肝胰腺是对虾最大的免疫器官，具有保护肝胰腺的功能，在对抗细菌病毒具有重要作用。由图1可知，A组对虾的肝细胞形态受损严重，B细胞出现破裂和空泡化现象，其内部转运泡体积明显增大且增多，R细胞颜色较深出现深褐色液泡，由于管腔挤压导致肝小管出现严重变形和细胞坏死现象；与A组相比，B组对虾肝组织损坏程度减轻，细胞破裂程度减轻，排列较整齐，B细胞空泡化现象减轻，R细胞相对增加。各猪毛蒿粉添加组均有不同程度的改善，0.5%组~4.0%组对虾肝细胞破损程度明显减轻，B细胞空泡化现象明显减轻，R细胞明显增多，与B组相比，细胞形态更加规整，且R细胞数量更多，肝小体结构完整，排列紧密且管腔成规则的四角或五角星形。研究表明，添加猪毛蒿粉可较好地改善对虾肝胰腺组织形态。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.011.F001图1猪毛蒿粉对南美白对虾肝胰腺组织形态的影响（20×）2.5猪毛蒿粉对南美白对虾肝胰腺抗氧化能力的影响（见表6）对虾没有获得性免疫功能，因此提高对虾自身非特异免疫力、增强抗病力具有重要意义。由表6可知，与A组相比，各猪毛蒿粉添加组对虾肝胰腺MDA含量显著降低（P0.05），SOD、CAT、PPO活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.011.T006表6猪毛蒿粉对南美白对虾肝胰腺抗氧化能力的影响组别MDA/(nmol/g prot)SOD/(U/mg prot)CAT/(U/mg prot)PPO/(U/mg prot)A组2.32±0.19a91.02±5.00b91.38±7.71c1.52±0.07cB组1.63±0.11b133.30±7.43a91.88±8.32b1.62±0.38c0.5%组1.29±0.05c113.20±5.33a105.16±8.49b2.04±0.12b1.0%组1.15±0.05c125.22±3.51a120.83±5.66a2.05±0.16b2.0%组1.16±0.07c128.27±3.13a108.83±4.65a2.55±0.46b4.0%组1.19±0.05c127.13±8.03a118.30±6.40a2.92±0.13a8.0%组1.21±0.03c128.13±8.79a121.65±2.90a3.03±0.17a2.6猪毛蒿粉对南美白对虾免疫力的影响根据猪毛蒿粉对对虾生长性能、病理学形态检测及抗氧化能力等结果发现，饵料添加1.0%猪毛蒿粉效果较好，因此选择1.0%猪毛蒿粉考察其免疫效应的关键分子Toll样受体（TLR）的影响，见图2。图2猪毛蒿粉对南美白对虾Toll-1和Toll-2在mRNA水平相关表达的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.011.F2a1（a）Toll-110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.011.F2a2（b）Toll-2由图2可知，与A组相比，添加1%猪毛蒿粉南美白对虾肝胰腺组织中Toll-1和Toll-2在mRNA表达量显著下降（P0.05）。3讨论3.1猪毛蒿粉对南美白对虾的生长性能的影响本试验发现，添加0.5%~8.0%猪毛蒿粉对南美白对虾的存活率、增重率、特定生长率、饵料系数、肥满度具有显著性影响，原因可能是在饲喂过程中，猪毛蒿中含有的黄酮类等免疫活性物质在对虾体内产生一定沉积，可以提高虾体组织、器官的屏障防御功能，增强自然杀伤细胞的杀伤功能，在一定程度上有助于增加机体的耐应激能力，提高对虾的存活率[16]。猪毛蒿中含有蛋白质、矿物质和各种维生素等营养物质和锌、锰等其他机体必要的微量元素和有机酸等，这些物质在机体内参与核酸、碳水化合物、脂质和蛋白质的代谢，提高机体的代谢水平和对营养物质的利用率，降低饵料系数，促进南美白对虾的生长[16]。3.2猪毛蒿粉对南美白对虾养殖水体水质的影响亚硝酸盐是制约南美白对虾养殖产业发展的重要因素[18]。亚硝酸盐在水中蓄积会导致养殖水体pH值升高，亚硝酸盐来自氨氮，由于亚硝化作用氨氮转化生成亚硝酸盐，之后亚硝酸盐硝化转变为硝酸盐，由于硝化作用与亚硝化作用无法达到平衡，会造成亚硝酸盐在水中蓄积[19]。南美白对虾自身的适应力和抗胁迫能力有限，由于亚硝酸盐蓄积过多，可能造成养殖环境的应激强度超过南美白对虾自身适应的能力或忍受力，引起对虾生理功能紊乱，降低其对细菌和病毒的抵抗力和免疫力，易引起肝胰腺发生病变，甚至导致急性肝胰腺坏死综合征，使对虾大量死亡，严重影响对虾养殖的成活率和经济效益[20]。本试验发现，添加猪毛蒿粉能够不同程度地降低养殖水体中氨氮和亚硝酸盐含量，提高南美白对虾的存活率，原因可能是猪毛蒿粉能够降低对虾的应激强度。此外，猪毛蒿中含有大量的多酚类、黄酮类、香豆素类、萜类及有机酸类等物质，成分多呈酸性或中性，有利于维持养殖水体环境pH值，二氧化碳的溶解度降低，氨氮含量累积减少。3.3猪毛蒿粉对南美白对虾非特异性免疫力的影响南美白对虾是一种非常简单的水生动物，只有简单的消化系统（胃、肝胰腺、肠道），缺乏完整的特异性免疫机制。南美白对虾通过非特异性免疫反应完成机体的免疫应答应对病原微生物的侵害[21]。肝胰腺是南美白对虾最大的免疫器官，具有解毒排毒功能，也是南美白对虾最脆弱的器官。肝胰腺轻度受损，会引起生长缓慢，大小不均；肝胰腺严重受损，会发生肝肿大、肝萎缩、糜烂等现象，甚至引起大量死亡。MDA、SOD、CAT是南美白对虾肝胰腺内抗氧化及非特异免疫的重要指标，而PPO是虾体中普遍存在的一种含铜金属蛋白，是虾体发生黑变的主要原因，也是虾保鲜品质控制中亟待解决的技术关键[22]。当水产动物在环境中受病原体、致病菌感染时，其体内的免疫系统会被触发，血细胞的呼吸活度会增加，从而产生活性氧以消除病原体和致病菌的消极影响[23]；但在消除病原体和致病菌的影响时会伴随机体严重损耗，当活性氧数量不断增加时，机体氧化还原状态失衡，严重者可产生氧化应激[24]。因此，急性胁迫条件引起的南美白对虾产生的免疫应激反应可通过降低虾体内MDA含量，提高其抗氧化酶活性缓解[25]。饵料添加猪毛蒿粉能够显著降低南美白对虾肝胰腺中MDA含量，提高SOD、CAT、PPO活性，从而明显提高南美白对虾肝胰腺的抗氧化能力。TLR是参与非特异性免疫反应的一类重要的蛋白质分子，是机体对抗病原微生物入侵产生免疫效应的关键分子。病原微生物表面某些共有的高度保守的分子结构（motifs）能够被TLR识别，向机体提供微生物感染的信号，诱导产生一系列的免疫效应因子和免疫反应[26]。已发现多种对虾中存在TLR，TLR基因的表达水平被国内外作为一项重要分子水平指标衡量虾类免疫机能。Wang等[27]研究发现，LvToll-1、LvToll-2、LvToll-3这3种LvToll存在于南美白对虾体内。在南美白对虾感染白斑综合征病毒（WSSV）后，3种LvToll表达均被上调；在其感染溶藻弧菌（V. alginolyticus）后，LvToll-2和LvToll-3表达没有变化，LvToll-1表达增加。本试验发现，添加猪毛蒿粉可促使对虾中Toll-1和Toll-2在mRNA表达水平下调，从而显著增强南美白对虾的免疫力，原因可能与猪毛蒿粉中含有黄酮类和香豆素类等成分有关。黄酮类化合物和香豆素类能够清除体内自由基，降低自由基所致的MDA产生[28-29]，抑制Fe2+和维生素C诱导的脂质过氧化作用[30]，提高动物机体抗氧化能力，从而增强南美白对虾的非特异性免疫力。4结论本研究结果显示，饵料添加猪毛蒿粉能够促进南美白对虾的生长，提高抗氧化能力和非特异性免疫力，改善养殖水体环境，添加1.0%~2.0%猪毛蒿粉效果较好。