三叶青（Cymbidium trifolium）为葡萄科崖爬藤属植物，野生三叶青需生长在海拔700 m的深山茂林的背阴面，散射光和细水涵养，适宜在18 ℃左右条件下生长，生长速度缓慢[1-2]。传统中医常以三叶青块根或全草入药，可用于治疗高热、扁桃体炎、肝炎、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病，也是抗肿瘤常用药物[3-5]。三叶青的药用成分主要是黄酮类物质[6-7]，具有显著的药用功效和动物饲养功能；艾蒿黄酮可提高肉鸡的生长性能，改善肉品质[8]。饵料中添加藤茶总黄酮可改善杂交鲟幼鱼的肠道消化酶活性、肠道皱襞高度和血清免疫水平[9]。日粮中添加大豆异黄酮能够提高断奶仔猪的生长性能，增强机体抗应激能力，对肠绒毛有一定保护作用[10]。大豆异黄酮具有抗氧化、防热应激、预防血液循环系统疾病、维持动物正常生殖机能、提高免疫能力、抗肿瘤以及提高禽类生产能力和改善其蛋、肉品质等功能[11]。关于三叶青的研究多集中在化学成分、成分提取、药理、药效和临床应用等，涉及培养三叶青细胞培养生产黄酮的研究报道较少。本研究旨在建立三叶青细胞悬浮培养体系，探究三叶青细胞悬浮培养的方法快速生产黄酮的可行性，为缓解资源短缺的问题提供参考。1材料与方法1.1试验材料三叶青愈伤组织培养：外植体前处理剪取三叶青新生嫩叶，使用体积分数1%洗洁精洗涤并用流水反复清洗后，浸泡75%乙醇3~5 min，无菌水冲洗3次，浸泡2%次氯酸钠3~5 min，无菌水冲洗3~5次，消毒后的三叶青外植体留下带腋芽的1.0~1.5 cm的茎段接于初代培养基（MS＋1.5 mg/L ６BA＋0.025 mg/L NAA）进行诱导培养，露出腋芽。每个处理接种30个外植体，培养至45 d时观察并统计生长情况，收获成熟的愈伤组织。MS培养基、1/2 MS参照谭玉珍[12]方法配制。B5培养基参照周维燕[13]方法配制。N6基础培养基参照李浚明[14]方法配制。1.2测定指标及方法1.2.1三叶青细胞悬浮体系建立与同步化培养[15]将呈乳白色、生长旺盛、小颗粒堆积生长、颗粒间结合松散、颗粒表面有瘤状小突起的三叶青愈伤组织约1 g转入pH值5.8的100 mL MS + 6-BA 2 mg/g的250 mL三角瓶中，置于25 ℃、2 000 Lux、120 r/min悬浮振荡培养15 d。使愈伤组织上的细胞脱落至液体培养体中，增加细胞的分散程度。培养物摇匀，静止片刻，大块的愈伤组织和细胞团下沉，将上清部分转入至一个空灭菌三角瓶，在静止直至细胞团基本沉入瓶底，弃去1/2的上清，添加新鲜培养基继代培养7 d，获得悬浮细胞团。1.2.2黄酮的提取与含量测定[16]准确称取芦丁对照品5 mg，置于80 ℃电热恒温鼓风干燥箱干燥至恒重，使用70%乙醇充分溶解，使用25 mL容量瓶定容，混匀，配制0.2 g/L芦丁标准溶液，分别量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL对照品溶液，置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇至6.0 mL，滴加1.0 mL 5%NaNO2，摇匀，放置6 min，加入1.0 mL 10% Al(NO3)3，摇匀，放置6 min，加入10.0 mL 10% NaOH溶液，70%乙醇定容，摇匀，放置15 min，以相应试剂作空白，测定500 nm处吸光度。以吸光度为横坐标，以对照品溶液的质量浓度为纵坐标绘制标准曲线。精确吸取供试品溶液1.0 mL于25 mL容量瓶中，按标准曲线的绘制中所用的方法对样品溶液进行显色，依据标准曲线，计算样品中的总黄酮含量。1.2.3悬浮培养产黄酮条件的研究1.2.3.1不同基础培养基对悬浮细胞生长和黄酮含量的影响分别以MS、1/2 MS、B5、N6基础培养基接种1.2.1获得细胞悬浮体系，在25 ℃、2 000 Lux、120 r/min，接种量10 mL/L，pH值5.8，激素以诱导的愈伤组织所用组合悬浮培养7 d，提取总黄酮，测定黄酮量，确定最佳培养基。1.2.3.2不同激素组合对悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响分别以因素6-苄氨基嘌呤（6-BA，A）、2,4-二氯苯氧乙酸（2-4D，B）、萘乙酸（NAA，C）、6-糠氨基嘌呤（6-KT，D）等因素进行4因素3水平正交试验[17-18]，25 ℃、2 000 Lux、120 r/min、接种量10 mL/L、pH值5.8、7 d后提取总黄酮，测定黄酮含量，确定最佳激素水平条件。L9(34)正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.016.T001表1L9（34）正交试验因素水平设计水平ABCD10.51.510.421.52.520.832.53.531.2mg/L1.2.4单因素试验1.2.4.1接种量对悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响在25 ℃、2 000 Lux、110 r/min、pH值5.8、悬浮培养7 d条件下，分别以5、15、25、35 mL/L接种量，提取总黄酮，测定黄酮量，确定最佳接种量。1.2.4.2摇床转速对悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响在25 ℃、2 000 Lux、pH值5.8下悬浮培养7 d，分别以90、110、130、150 r/min的摇床转速提取总黄酮，测定黄酮量，确定最佳培养转速。1.2.4.3光照方式对悬浮细胞培养生长和黄酮含量的影响在25 ℃、2 000 Lux条件下悬浮培养7 d，分别以持续黑暗、8 h/d照射、16 h/d照射、连续照射的方式，筛选有利于悬浮细胞生长和黄酮含量相对较高的最佳培养方式。1.2.4.4pH值对悬浮细胞培养生长和黄酮含量的影响在25 ℃，2 000 Lux下悬浮培养7 d后，分别以pH值为5.4、5.8、6.2、6.6的培养基进行悬浮培养，提取总黄酮，测定黄酮量，以确定悬浮细胞适宜的培养基的pH值。1.2.4.5培养天数对悬浮细胞培养生长和黄酮含量的影响在25 ℃ 、2 000 Lux、pH值5.8相同培养条件下，分别于培养后的第4、7、10、13、16、19、22、25 d测定黄酮量，以确定最佳培养时间。2结果与分析2.1芦丁的标准曲线（见图1）由图1可知，芦丁质量浓度x与吸光度y的回归方程为y=0.025x+0.012。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.016.F001图1芦丁的标准曲线2.2不同培养基对三叶青悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响（见表2）由表2可知，MS培养基最利于细胞的生长和黄酮的积累，1/2 MS培养基次之。MS培养基中无机养分的数量和比例均较合适，可以满足植物细胞在营养和生理上的需要。与其他培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵含量高，而B5、N6培养基铵含量低，配方不利于细胞悬浮培养。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.016.T002表2不同培养基对三叶青悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响培养基细胞干重/g黄酮含量/(mg/g)MS培养基0.5986.2581/2 MS培养基0.5595.877B5培养基0.3463.221N6培养基0.021—注：“—”表示空缺。2.3激素组合对三叶青悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响（见表3、表4）三叶青悬浮培养细胞对培养基的营养成分比愈伤组织具有更大的依赖性，悬浮细胞对培养基和激素也更为敏感。由表3R值可知，各激素对黄酮影响排序为ADCB，通过k值可知，各因素最优组合为A2B1C2D1，以最优组合做3次平行3次重复试验，得到细胞干重0.518 g，黄酮含量7.493 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.016.T003表3激素组合对悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响项目A/(mg/L)B/(mg/L)C/(mg/L)D/(mg/L)细胞干重/g黄酮含量/(mg/g)111110.4725.823212220.4185.629313330.3395.478422230.4926.201522310.4206.493623120.3625.652731320.4095.720832130.3795.226933210.4646.001k15.6435.9155.5676.106k26.1155.7835.9445.667k35.6495.7105.8975.635R0.4720.2050.3770.471主次因素ADCB最优组合A2B1C2D1本次正交设计没有安排空白列，因此每个指标做3次重复试验，试验结果利用SPSS 22.0软件进行了方差分析，得出了试验因素对指标影响的显著性，见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.016.T004表4正交试验方差分析结果项目偏差平方和自由度均方F值P值显著性A1.31820.65935.7060.01**B0.18820.0945.1040.05*C0.76020.38020.5840.01**D1.25420.62733.9760.01**误差0.332180.018注：“**”表示影响极显著（P0.01），“*”表示影响显著（P0.05）。由表4中F检验结果可知，添加6-BA、NAA、6-KT对黄酮含量具有极显著影响（P0.01），2-4D对黄酮含量显著具有显著影响（P0.05）。由于本试验重点考察指标为黄酮含量，且试验数据表明细胞干重与黄酮含量基本呈正相关，即细胞干重大黄酮含量也高，因此不再单独分析细胞干重。2.4光照方式对三叶青悬浮细胞培养生长和黄酮含量的影响（见表5）由表5可知，在不同的光照方式下培养，细胞的增长和黄酮的积累含量差异较大，8 h/d的光照后，随着光照时间增加，培养物和黄酮的积累量呈负相关关系。黑暗培养除了细胞增长慢黄酮积累少之外，培养物呈白色，活力较低。因此，以8 h/d照射下细胞增长最快，黄酮含量也最大，可达11.262 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.016.T005表5光照方式对三叶青悬浮细胞培养生长和黄酮含量的影响光照方式细胞干重/g黄酮含量/(mg/g)8 h/d照射0.96611.26216 h/d照射0.80210.536连续光照0.5628.624持续黑暗0.5728.7682.5摇床转速对三叶青悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响（见表6）由表6可知，当摇床转速90 r/min时，细胞增长缓慢；当细胞转速为130 r/min时，细胞团多呈散碎状，细胞贴壁严重，随着摇床转速增高，细胞增长和黄酮积累逐渐增加，在110 r/min时达到最大值，黄酮含量为12.246 mg/g，而后出现下降趋势。原因是转速越高溶氧量越高，细胞增殖快，超过一定限度后由于剪切力过大而破坏了细胞，使培养细胞大量死亡。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.016.T006表6摇床转速对三叶青悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响摇床转速/(r/min)细胞干重/g黄酮含量/(mg/g)900.98610.3261101.12612.2461300.8759.9681500.4867.5622.6接种量对三叶青悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响（见表7）由表7可知，在接种量为35 mL/L时，细胞干重达到最高，为1.322 g，黄酮含量低于接种量为5、15、25 mL/L，为9.244 mg/g。通过试验观察可知，接种量为35 mL/L时，悬浮的细胞易褐化。任何一个悬浮培养细胞系均具有一定的最适生长密度[12]。因此，接种量为25 mL/L时是较佳培养条件，黄酮含量为14.614 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.016.T007表7接种量对三叶青悬浮培养细胞生长和黄酮含量的影响接种量/(mL/L)细胞干重/g黄酮含量/(mg/g)50.84010.342150.86611.462251.25114.614351.3229.2442.7pH值对三叶青悬浮细胞培养生长和黄酮含量的影响（见表8）由表8可知，pH值的变化对细胞的增长和黄酮产物的积累具有明显的规律，在pH值为5.8时黄酮含量达到最大值16.612 mg/g，之后随着pH值增加呈下降趋势。pH值的变化是影响酶的催化作用产黄酮的主要因素之一，pH值改变，酶所催化的能力也随之改变。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.016.T008表8pH值对三叶青悬浮细胞培养生长和黄酮含量的影响pH值细胞干重/g黄酮含量/(mg/g)5.40.93010.2625.81.45216.6126.20.84813.2626.60.82610.9242.8培养天数对三叶青悬浮细胞培养生长和黄酮含量的影响（见表9）由表9可知，0~4 d细胞增长增速度慢，应为细胞的适应期；4~13 d细胞增长快，应为对数期；16~25 d，生长平缓，甚至有下降趋势，细胞生存空间密度达到最大，为静止期。在适应期黄酮的积累含量最低，当进入对数期后，第13 d黄酮积累量逐渐增加，达20.524 mg/g，随后进入稳定期，黄酮含量变化不明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.016.T009表9培养天数对三叶青悬浮细胞培养生长和黄酮含量的影响培养时间/d细胞干重/g黄酮含量/(mg/g)40.9324.24271.0227.822101.22414.528131.54220.524161.22317.246191.21016.428221.30215.424251.24814.252通过以上单因素试验和正交试验，得到三叶青最佳培养基组成MS + 1.5 mg/L 6-BA + 1.5 mg/L 2-4D + 2 mg/L NAA + 0.4 mg/L 6-KT，最佳培养条件为8 h/d光照，摇床转速110 r/min，接种量25 mL/L，pH值5.8，培养时间为13 d，在此最优培养条件下黄酮积累量可达20.524 mg/g。3结论本试验优化后得到最佳的培养条件为以三叶青总黄酮含量为指标，三叶青悬浮细胞的最佳培养条件为采用MS 培养基、照射8 h/d、摇床转速110 r/min、接种量25 mL/L、pH 值5.8、培养时间13 d、6-BA 1.5 mg/g、2-4D 1.5 mg/g、NAA 2 mg/g、6-KT 0.4 mg/g 的激素组合。在此最佳条件下，三叶青的黄酮含量为20.524 mg/g。