铬是金属元素，化学符号Cr，原子序数24，为银白色有光泽的金属。铬是动物体必需的微量元素，作为葡萄糖耐受因子（GTF）的活性成分与胰岛素发挥协同生理作用，参与糖、蛋白质、脂类和核酸的代谢[1]。在动物饲料中添加一定量的铬可以调节免疫力，降低背膘厚度，提高酮体瘦肉率，减缓应激[2]。动物体若缺铬会导致葡萄糖利用率受阻、生长缓慢、寿命缩短、血清胆固醇含量以及冠状动脉硬化率升高等[3]。饲料行业常采用添加吡啶甲酸铬、烟酸铬、丙酸铬等有机铬弥补铬的不足[4]，但饲料中铬含量过高会引起动物体出现中毒的现象，损害肝、肾功能，影响动物生长速率，因此准确检测饲料中的铬含量具有重要意义。目前，测铬的方法主要有电感耦合等离子体发射光谱法[5-6]、电感耦合等离子体质谱法[7-8]、分光光度法[9]、石墨炉原子吸收法[10]和火焰原子吸收光谱法[11]。《饲料卫生标准》（GB 13078—2017）[12]中明确规定了铬的检测方法为《饲料中铬的测定》（GB/T 13088—2006）[13]中的原子吸收光谱法，可见火焰原子吸收光谱法的重要性。本试验根据实际需求，对原子吸收光谱法方法进行优化，为测定混合型饲料添加剂、微量元素预混合饲料以及矿物质饲料原料中的铬含量提供参考。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1试验试剂硝酸、盐酸、氢氟酸、高氯酸（分析纯，西陇化工股份有限公司），氯化铵（分析纯，广东光华科技股份有限公司），铬、铜、铁、锰、锌、碘、硒、钴、钾、钠、钙、镁标准溶液（1 000 mg/L，国家有色金属及电子材料分析检测中心），试验用水均为GB/T 6682规定的三级水。铬标准储备液：铬标准溶液以纯水稀释至100 mg/L。10%氯化铵溶液：称取10 g氯化铵置于200 mL烧杯中，以50 mL纯水溶解，转移定容至100 mL容量瓶中。1.1.2仪器设备WYS2000原子吸收分光光度计（安徽皖仪科技股份有限公司）、高性能空心阴极铬灯（北京有色金属研究总院）、LC-20AT高效液相色谱仪（岛津公司）、ICAP PROX DUO电感耦合等离子体发射光谱仪（赛默飞世尔）、ME240E分析天平（梅特勒-托利多有限责任公司）、UPR-Ⅱ-10T超纯水仪（优普超纯科技有限公司）、DS-3石墨控温电热板（常州普天仪器制造有限公司）。1.2测定指标及方法1.2.1样品配制根据四川新一美生物科技有限公司技术配方分别配制混合型饲料添加剂吡啶甲酸铬（混添吡啶铬，铬含量：2 000 mg/kg）、混合型饲料添加剂丙酸铬（混添丙酸铬，铬含量：4 000 mg/kg）、猪用微量元素预混合饲料（猪微矿预混料，铬含量：400 mg/kg，铬源为吡啶甲酸铬）、禽用微量元素预混合饲料（禽微矿预混料，铬含量：200 mg/kg，铬源为丙酸铬）。矿物质饲料原料分别为麦饭石、石粉（绵阳载微宝科技有限公司提供）和沸石粉（平桥区志伟矿业制品厂）。各样品中铬元素含量见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.023.T001表1各样品中铬元素含量项目混添吡啶铬混添丙酸铬猪微矿预混料禽微矿预混料含量（理论值）2 0004 000400200mg/kg1.2.2样品制备混合型饲料添加剂、微量元素预混合饲料和矿物质饲料原料样品经四分法缩取200 g，全部通过0.45 mm孔径分析筛，混匀。1.2.3样品处理分别称取混合型饲料添加剂0.2 g，微量元素预混料1.0 g，矿物质饲料原料5.0 g精确至0.000 1 g，于150 mL聚四氟乙烯烧杯中，以纯水润湿，加入15 mL盐酸于电热板上低温加热至微沸，取下稍冷，加入5 mL硝酸，待剧烈反应完全，加入10 mL氢氟酸继续加热至体积约为10 mL，加入5 mL高氯酸，继续加热至白烟完全冒尽，取下，加入2 mL硝酸，以纯水冲洗烧杯内壁，加热煮沸溶解盐类，取下冷却，定量转移过滤至100 mL容量瓶中，加入4 mL 10%氯化铵溶液，混匀。随同试样做试剂空白试验。1.2.4标准曲线绘制分别准确移取铬标准储备液0、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00 mL于100 mL容量瓶中，加入2 mL硝酸，4 mL 10%氯化铵溶液，以纯水定容至刻度，混匀，此标准系列的质量浓度为0、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00 mg/L，在仪器最佳条件下进行测定，以质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。曲线的线性相关系数R2=0.999 9，回归方程为：Y=0.016 9X+0.000 4。1.2.5仪器测定仪器工作参数见表2。在仪器最佳条件下，将标准系列、空白溶液和试样溶液分别导入仪器，测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标，质量浓度为横坐标制作标准曲线，对样品进行定量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.023.T002表2仪器工作参数项目参数项目参数负高压/V442.0背景校正氘灯扣背景灯电流/mA5.0波长/nm357.9燃烧头高度/mm10.0火焰类型空气-乙炔狭缝宽度/nm0.4测量方式标准曲线法乙炔流量/(L/min)2.1空气流量/(L/min)14.02结果与分析2.1试验条件的确定2.1.1干灰化对测定结果的影响（见表3）根据国家标准GB/T 13088—2006[13]中规定，样品需于600 ℃灼烧5 h。但含铬化合物在600 ℃以上的温度环境中大部分易发生氧化、分解、再氧化，与其他元素形成稳定的铬化合物。干灰化的目的是将饲料中的有机物碳化灼烧，防止消解过程产生碳吸附待测金属元素，导致检测结果偏低。而无机微量元素添加剂和预混料中多采用麦饭石、沸石粉等无机矿物质作为载体稀释剂，这类矿物质饲料原料的主成分均为硅铝酸盐，经600 ℃的高温灼烧后易导致金属元素被包裹，很难溶解。因此，试验将样品分别按照国家标准GB/T 13088—2006[13]中规定的干灰化法和本研究所述方法进行对比。由表3可知，灼烧后的样品由于硅铝酸盐的影响导致铬检测数据严重偏低。混合型饲料添加剂、微量元素预混合饲料以及含硅铝酸盐较高的饲料原料沸石粉的检出率低于50%，严重影响铬的检测，仅对硅铝酸盐含量不高的石粉影响较小。因此，检测硅铝酸盐含量较高的添加剂、预混料、矿物质原料时不能进行干灰化处理。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.023.T003表3干灰化对测定结果影响项目混添吡啶铬猪微矿预混料沸石粉石粉理论值/(mg/kg)检测值/(mg/kg)检出率/%理论值/(mg/kg)检测值/(mg/kg)检出率/%理论值/(mg/kg)检测值/(mg/kg)检出率/%理论值/(mg/kg)检测值/(mg/kg)检出率/%干灰化2 00081740.8540017644.004.01.3634.000.951.03108.4本试验2 043102.20402100.504.17104.300.96101.12.1.2不同溶解体系检测、溶解结果（见表4、表5）国家标准GB/T 13088—2006[13]方法中仅加入5 mL 20%硝酸溶解样品，导致大部分样品溶解不完全。针对样品溶解不完全的问题，很多文献采用提高溶解效率的提高溶解效果，本试验将加大硝酸用量改为10 mL 50%硝酸溶解样品（体系一）[14]、改变溶解用酸采用50%热盐酸溶解样品（体系二）、使用混合酸50%盐酸-50%硝酸体系溶解样品（体系三）[15]常用提高溶解方法，与本研究所述溶解体系（盐酸-硝酸-氢氟酸-高氯酸溶解体系，体系四）溶解样品进行对比，结果见表4、表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.023.T004表4不同溶解体系检测结果项目混添丙酸铬猪微矿预混料禽微矿预混料理论值/(mg/kg)检测值/(mg/kg)检出率/%理论值/(mg/kg)检测值/(mg/kg)检出率/%理论值/(mg/kg)检测值/(mg/kg)检出率/%体系一4 0003 41285.3040034385.7520016080.00体系二3 44986.2335989.7517386.50体系三3 63690.9035689.0018592.50体系四4 077101.90401100.2019698.0010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.023.T005表5不同溶解体系溶解效果项目沸石粉麦饭石石粉理论值/(mg/kg)检测值/(mg/kg)检出率/%理论值/(mg/kg)检测值/(mg/kg)检出率/%理论值/(mg/kg)检测值/(mg/kg)检出率/%体系一4.003.1779.253.152.0765.710.950.96101.10体系二3.3182.752.1668.570.9296.84体系三3.0977.252.2370.791.03108.40体系四4.10102.503.0998.100.9498.95由表4、表5可知，除石粉以外，使用不同溶解体系溶解样品，检出率存在明显差异。矿物质饲料原料的检出率在65.71%~108.40%；混合型饲料添加剂、微量元素预混料的检出率在80.00%~101.90%。微量元素预混合饲料在生产过程中会加入大量硫酸盐，目前饲料行业通用的Cu、Fe、Mn、Zn、Co等元素均为硫酸盐，在微量元素预混料中的添加比例可达50%以上，大量硫酸盐的加入会导致待测样品基体与标准溶液基体差异较大；麦饭石、沸石粉因含有大量硅铝酸盐；故采用常规的盐酸、硝酸溶解体系容易导致结果偏低。本试验采用氢氟酸溶解矿物质饲料原料和载体稀释剂中硅铝酸盐，在高沸点酸存在的情况下样品中大量硫酸盐的分解温度降低，高氯酸和硫酸根共同作用，使硫酸根分解，从而破坏基体干扰。2.1.3共存元素干扰的测定结果（见表6、表7）Mg、Co、Al、V、Ni、Fe、Na、Ca对Cr的测定存在干扰[16]，Fe、Mg、Ca、Zn、Si、Cu、对Cr测定存在干扰[17]，Mn、Ni、V对Cr测定存在干扰[18]。而在微量元素预混合饲料中存在大量的Fe、Cu、Zn、Mn、I、Se、K、Mg元素。称取1 g样品溶解，定容至100 mL时，根据表6样品含量和表1中铬元素含量可知，干扰元素的理论最大量即为表7中待测溶液中含量，铬的理论量即为表7中Cr理论值。使用各元素的标准溶液配制待测干扰元素和Cr理论值相同比例溶液，于仪器最佳条件下检测Cr的含量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.023.T006表6样品配方含量项目CuFeZnMnISeCoKMg猪微矿预混料15.00130.0090.0040.001.000.70———禽微矿预混料10.0030.0040.0040.000.700.250.0690.0050.00注：“—”表示配方中未添加此元素。g/kg10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.023.T007表7干扰元素测定结果项目CuFeZnMnISeCoKMg待测溶液中含量150.001 300.00900.00400.0010.007.000.60900.00500.00Cr理论值4.004.004.004.004.004.004.004.004.00Cr检测值4.234.064.653.984.213.984.224.383.18g/L由表7可知，金属元素Mg对Cr的测定存在严重负干扰；金属元素Cu、Zn、Co、K、I对Cr的测定存在正干扰，在正干扰的情况下，若采用GB/T 13088—2006[13]方法溶解样品会使检测结果依然严重偏低；而Fe、Mn、Se对Cr的测定无影响；加入氯化铵可屏蔽干扰[16]。2.1.4基体干扰测定结果（见表8）标准加入法一般用于组分复杂的样品，能够消除基体对待测组分的干扰。试验依据GB/T 13088—2006[13]方法不干灰化（由于存在大量硅铝酸盐）20%硝酸溶解样品和本研究方法溶解样品，加入0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mg/L溶液，测定溶液质量浓度与吸光度的曲线，与直接配制的标准曲线对比。延长标准加入法曲线和横坐标相交的数的绝对值即为样品真实含量，计算结果与理论值完全吻合。由表8可知，GB/T 13088—2006[13]方法不干灰化处理样品后做的标准加入法曲线的斜率比直接配制曲线低，表明样品基体干扰非常严重，而本研究所述方法标准加入曲线斜率与直接配制曲线斜率基本一致，基体干扰基本消除。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.023.T008表8基体干扰测定结果配置方式配制溶液处理方式曲线回归方程混添吡啶铬/(mg/kg)检测结果理论值标准加入法GB/T 13088—2006Y=0.012 1X+0.025 11 9742 000本研究方法Y=0.016 5X+0.034 92 015直接配制曲线纯水Y=0.016 9X+0.000 41 7512.1.5待测溶液介质选择按照本试验描述方法溶解样品后，盐酸、硝酸、氢氟酸和高氯酸均被赶尽，需加入一定的酸溶解盐类，作为待测溶液的介质。本试验选用了硝酸、盐酸以及硝酸-盐酸混合介质，保证标准溶液体系与待测溶液介质一致，检测结果无影响，确定待测溶液介质为2%硝酸。2.2仪器最佳条件选择结果2.2.1燃助比选择火焰原子吸收光谱法测Cr时，容易与某些物质形成高熔点、难挥发、难离解的氧化物，导致吸光度下降，灵敏度降低。采用还原性强的富燃型火焰可使难离解的氧化物还原分解：CrO+C=Cr+CO。但随着乙炔流量增大，灵敏度越高，稳定性越差。混合型饲料添加剂、微量元素预混合饲料中的Cr含量很高，可以适当牺牲灵敏度，选择稳定性较好的燃助比进行检测，因此采用乙炔流量为2.1 L/min、空气流量为14 L/min进行试验。2.2.2狭缝宽度选择火焰原子吸收光谱法狭缝越宽，光通量越大，光谱干扰就越严重。消除光谱干扰常用的方法是减小狭缝宽度，使光谱通带小到足以分离掉非吸收线，但狭缝减小的同时灵敏度也会随之下降。目前原子吸收狭缝有0.2、0.4、0.8、1.0 nm等，试验采用稳定性较好的0.4 nm作为工作狭缝宽度。2.2.3光谱干扰消除石粉、磷酸氢钙等矿物质饲料原料在检测过程中，具有非常严重的背景干扰，需采用氘灯扣背景降低或者消除干扰[19]，否则检测结果严重偏高。2.3线性相关性和方法检出限测定结果在仪器最佳条件下进行线性关系试验，结果见表9、图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.023.T009表9线性范围和曲线方程项目标准溶液浓度/(mg/L)00.501.002.004.005.00吸光度0.000 50.008 60.017 50.034 10.067 60.085 3曲线方程Y=0.016 9X+0.000 410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.023.F001图1线性相关性曲线由表9、图1可知，此方法在0~5.00 mg/L范围内线性良好。按照本研究确定的试验条件，测定10组试样空白，结果见表10。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.023.T010表1010组空白测定值项目空白测定次数12345678910空白吸光度0.000 40.000 60.000 40.000 10.000 20.000 40.000 100.000 40.000 1平均值0.000 27检出限/(mg/kg)0.000 90参考《合格评定 化学分析方法确认与验证指南》（GB/T 27417—2017）[20]，方法检出线空白标准偏差评估法：检出限=样品10次空白平均值+3倍标准偏差。由表10可知，计算方法检出限为0.000 9 mg/kg，满足检测要求。2.4方法精密度与准确度测定结果2.4.1精密度与加标回收率测定结果（见表11）混合型饲料添加剂、微量元素预混合饲料、矿物质饲料原料样品按照本研究确定的最佳试验条件分别做了10组平行样品检测，并对样品做加标回收率验证试验。由表11可知，方法的精密度（RSD）在2.26%~5.91%，样品加标回收率为95.50%~103.10%，方法精密度好，回收率高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.023.T011表11精密度与回收率测定结果项目混添吡啶铬混添丙酸铬猪微矿预混料禽微矿预混料麦饭石沸石粉石粉结果1/(mg/kg)1 9594 0334211923.163.960.960结果2/(mg/kg)2 0654 0264092033.554.131.030结果3/(mg/kg)1 9933 9894172093.424.090.990结果4/(mg/kg)2 0274 1413962123.174.110.890结果5/(mg/kg)2 1553 9353921993.094.160.980结果6/(mg/kg)1 9684 2364062033.524.090.990结果7/(mg/kg)2 1103 9114092053.464.181.030结果8/(mg/kg)2 0194 0713991943.194.211.050结果9/(mg/kg)2 0234 0194072033.074.320.960结果10/(mg/kg)2 0473 9923962063.084.111.030平均值/(mg/kg)2 036.6004 035.300405.200202.6003.2714.1360.991标准偏差(S)61.04095.8109.4506.2000.1900.0900.050RSD/%3.002.372.333.065.912.264.79加标量/(mg/kg)2 0002 000400200551加标后检测结果/(mg/kg)4 0625 941806.000391.0008.1109.0101.940回收率/%103.1097.05101.5095.5099.20100.2099.002.4.2不同方法检测结果（见表12）常用的分析结果准确度的检验方法有平行测定、标准物质对照和不同分析方法对照[21]。由于目前并无混合型饲料添加剂、微量元素预混料和矿物质饲料原料中铬的标准对照样品，本研究采用高效液相色谱法测有机铬、ICP光谱法测饲料中铬来进行对比验证。由表12可知，方法准确度符合检测要求，混合型饲料添加剂中总铬含量和吡啶甲酸铬含量无显著差异，ICP光谱法和本研究方法检测结果均在检测允许误差范围内。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.023.T012表12不同方法检测结果项目混添吡啶铬混添丙酸铬猪微矿预混料禽微矿预混料麦饭石沸石粉石粉本研究方法/(mg/kg)2 0394 1334011963.163.951.03ICP光谱法/(mg/kg)2 1464 0964092033.034.110.96HPLC/%1.69——————注：1.HPLC检测结果为吡啶甲酸铬含量，吡啶甲酸铬与铬的换算系数为8.045 042。2.“—”表示未进行HPLC检测。3结论火焰原子吸收光谱法测定混合型饲料添加剂、微量元素预混料以及矿物质饲料原料中铬的含量时，需采用盐酸、硝酸、氢氟酸充分溶解样品，采用高氯酸冒烟赶酸同时减小基体干扰，以10%氯化铵屏蔽金属离子干扰，以2%硝酸作为检测介质，方法简便、快捷、设备成本低、准确度高、精密度好、标准物质测定结果在允许范围内。