微藻富含蛋白质、脂质、藻多糖、β-胡萝卜素等，其中脂质含有丰富的不饱和脂肪酸，如二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等。微藻在鱼类饵料中应用可以节约蛋白质，调控鱼体脂质代谢，提高免疫功能和繁殖性能，是鱼油的良好替代物[1-2]。微藻脂质的提取工艺已较为成熟，如微拟球藻总脂和EPA的提取[3-5]，且在鱼类养殖中应用效果良好。与鱼油相比，藻油可以显著提高泰国斗鱼幼鱼的成活率[6]，刺激草鱼幼鱼蛋白质沉积，获得更好的生长效果[7]，显著增强大菱鲆幼鱼的消化、抗氧化和免疫能力[8]。目前，微藻产油具有较高的成本，限制了微藻脂质在鱼类饵料中的应用。微藻脂质储存在脂滴（LD）中[9-11]，因此增加脂质在微藻LD中的积累至关重要。研究发现，微藻LD蛋白可影响LD脂质累积，如微拟球藻LDSP蛋白可以调控LD大小[12]，巴夫杜氏藻MLDP蛋白与甘油三酯的累积具有共调控关系[13]，雨生红球藻HOGP蛋白表达量的增加可以提高甘油三酯的含量[14]，莱茵衣藻MLDP蛋白可以调控LD大小[15]。因此，本研究应用生物信息学方法分析以上4种微藻LD蛋白的结构特征，有助于理解其影响LD脂质累积的机制，为提高微藻产油量、开发高效产脂工程株提供参考，从而推动藻油鱼类饲料的研发和应用。1材料与方法1.1试验材料微拟球藻LDSP蛋白（ID：H6WNF3）、巴夫杜氏藻MLDP蛋白（ID：G9L6P6）、雨生红球藻HOGP蛋白（ID：E2JF04）、莱茵衣藻MLDP蛋白（ID：A8J816）的氨基酸序列从Uniprot数据库获取。1.2测定指标及方法1.2.1微藻LD蛋白的理化性质分析采用ProtParam在线软件分析理化性质，提交氨基酸序列（单字母氨基酸缩写格式），得到氨基酸总数、相对分子质量、正电荷氨基酸总数、负电荷氨基酸总数、等电点、不稳定指数、脂肪指数和亲水性平均值。1.2.2微藻LD蛋白的亲/疏水性分析采用ProtScale在线软件分析亲/疏水性，提交氨基酸序列（单字母氨基酸缩写格式），选择Hphob./Kyte & Doolittle算法，得到蛋白质亲/疏水性图谱。1.2.3微藻LD蛋白的信号肽、跨膜结构域、双亲性α螺旋分析采用SignalP 5.0服务器分析信号肽，提交氨基酸序列（Fasta格式），选择真核生物，得到信号肽存在概率和图谱。采用Tmhmm 2.0在线软件分析跨膜结构域，提交氨基酸序列（Fasta格式），得到跨膜结构域的数量和图谱。采用HeliQuest服务器分析双亲性α螺旋，提交氨基酸序列（单字母氨基酸缩写格式），得到α螺旋的物理化学性质和氨基酸组成信息。1.2.4微藻LD蛋白的二级结构、结构域和三级结构分析采用Sopma在线软件分析二级结构，提交氨基酸序列（单字母氨基酸缩写格式），得到二级结构组成和图谱。采用Pfam数据库分析结构域，选择序列检索模块，提交氨基酸序列（单字母氨基酸缩写格式），得到结构域名称和匹配区域。采用Robetta服务器分析三级结构，提交氨基酸序列（单字母氨基酸缩写格式），得到三级结构预测文件，提交至Saves 6.0中的Procheck评估软件进行质量评估，得到拉式图。1.2.5微藻LD蛋白的保守基序分析采用Clustal Omega服务器分析保守基序，选择蛋白质序列比较模块，提交氨基酸序列（Fasta格式），得到多序列比较结果，星号表示该列所有氨基酸完全保守，冒号表示该列所有氨基酸具有相似的分子大小和相同的亲/疏水性，单点代表该列氨基酸分子大小和亲/疏水性较相似，但是不相似的氨基酸之间存在替换，无标记代表该列氨基酸完全不保守。采用ESPript 3.0在线软件注释多序列比对结果，将序列比对结果和微拟球藻LDSP蛋白的三级结构分别上传至比对序列和二级结构描绘模块，得到序列比对注释，相同的氨基酸标记为白色，相似的氨基酸标记为红色，不相似的氨基酸标记为黑色。1.2.6微藻LD蛋白的磷酸化位点分析采用NetPhos 3.1在线软件分析磷酸化位点，提交氨基酸序列（Fasta格式），选择预测位点类型为丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基，设置显示打分大于0.5的位点，得到磷酸化位点的打分和图谱。服务器和在线软件信息见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.T001表1服务器和在线软件信息项目功能地址Uniprot搜索蛋白质序列https://www.uniprot.orgProtParam理化性质分析https://web.expasy.org/protparam/ProtScale亲/疏水性分析https://web.expasy.org/protscale/SignalP 5.0信号肽分析https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0Tmhmm 2.0跨膜结构域分析https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0HeliQuest双亲性α螺旋分析https://heliquest.ipmc.cnrs.fr/Sopma二级结构分析https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.htmlPfam结构域分析http://pfam.xfam.org/Robetta三级结构预测https://robetta.bakerlab.org/submit.phpSaves 6.0拉式图分析https://saves.mbi.ucla.eduClustal Omega多序列比对https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ESPript 3.0蛋白质多序列比对注释https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgiNetPhos 3.1磷酸化位点分析https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.12结果与分析2.1微藻LD蛋白的理化性质分析（见表2）由表2可知，微拟球藻LDSP蛋白的氨基酸数量最少、相对分子质量最小、带电荷氨基酸数量最少，等电点偏碱性，不稳定指数最大但小于40，脂肪指数最大、亲水性平均值大于0，是稳定的碱性疏水蛋白；巴夫杜氏藻MLDP蛋白和雨生红球藻HOGP蛋白的各项理化性质较相似，是稳定酸性亲水蛋白，与微拟球藻LDSP蛋白的理化性质差异较大；莱茵衣藻MLDP蛋白的氨基酸数量、相对分子质量、带电荷氨基酸数量、不稳定指数与巴夫杜氏藻MLDP蛋白、雨生红球藻HOGP蛋白相似，但等电点偏碱性，脂肪指数大于90，亲水性平均值大于0，与微拟球藻LDSP蛋白相似，是稳定碱性疏水蛋白，表明微藻LD蛋白的生物活性出现分化，参与不同的生物学过程。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.T002表2微藻LD蛋白的理化性质分析项目微拟球藻LDSP巴夫杜氏藻MLDP雨生红球藻HOGP莱茵衣藻MLDP氨基酸总数/个158297275268相对分子质量16 713.1931 966.0129 780.9427 979.89负电荷氨基酸总数/个6222721正电荷氨基酸总数/个16212625等电点9.796.416.528.88不稳定指数/分33.4430.2023.9326.18脂肪指数/分114.1885.7683.7891.01亲水性平均值/分0.708-0.083-0.1310.1122.2微藻LD蛋白的亲/疏水性分析结果（见表3、图1）微藻LD蛋白的亲/疏水性差异较大。由图1（a）和图1（d）可知，微拟球藻LDSP蛋白（第5~154位）和莱茵衣藻MLDP蛋白（第5~264位）的最强亲水性位点均在N端，最强疏水性位点均在C端，亲水性氨基酸少于疏水性氨基酸。由图1（b）和图1（c）可知，巴夫杜氏藻MLDP蛋白（第5~293位）和雨生红球藻HOGP蛋白（第5~271位）的最强亲水性位点、最强疏水性位点均在N端，亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸。研究表明，微拟球藻LDSP蛋白和莱茵衣藻MLDP蛋白的C端可能定位在LD表面，属于疏水性蛋白质；巴夫杜氏藻MLDP蛋白和雨生红球藻HOGP蛋白的N端可能定位于LD表面，属于亲水性蛋白质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.T003表3微藻LD蛋白的亲/疏水性分析项目微拟球藻LDSP蛋白巴夫杜氏藻MLDP蛋白雨生红球藻HOGP蛋白莱茵衣藻MLDP蛋白亲水性最强位点Asp-66Arg-143Glu-108Gln-34/Asp-68亲水性最强位点得分-1.711-1.578-2.356-1.756疏水性最强位点Met-89Ile-47Thr-56Val-174疏水性最强位点得分2.9892.6002.5111.844亲水性氨基酸数目/个51179146111亲水性氨基酸比例/%34625543疏水性氨基酸数目/个99110121149疏水性氨基酸比例/%66384557图1微藻LD蛋白的亲/疏水性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F1a1（a）微拟球藻LDSP蛋白的亲/疏水性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F1a2（b）巴夫杜氏藻MLDP蛋白的亲/疏水性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F1a3（c）雨生红球藻HOGP蛋白的亲/疏水性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F1a4（d）莱茵衣藻MLDP蛋白的亲/疏水性2.3微藻LD蛋白的信号肽、跨膜结构域、双亲性α螺旋分析结果（见图2~图4）图2微藻LD蛋白的信号肽10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F2a1（a）微拟球藻LDSP蛋白的信号肽10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F2a2（b）巴夫杜氏藻MLDP蛋白的信号肽10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F2a3（c）雨生红球藻HOGP蛋白的信号肽微藻属于原生生物，细胞内具有细胞核和膜性细胞器，信号肽可以指导蛋白质定位到不同的细胞器上。由图2（a）~图2（d）可知，微拟球藻LDSP蛋白、巴夫杜氏藻MLDP蛋白、雨生红球藻HOGP蛋白、莱茵衣藻MLDP蛋白具有信号肽的可能性依次为0.001 6、0.028 4、0.000 6、0.000 8，为其他类型蛋白质的可能性依次为0.998 4、0.971 6、0.999 4、0.999 2，表明4种微藻LD蛋白均无信号肽，可能为其他类型蛋白质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F2a4（d）莱茵衣藻MLDP蛋白的信号肽跨膜结构域由疏水性氨基酸组成，一般为α螺旋结构。由图3（a）可知，微拟球藻LDSP蛋白具有两个跨膜结构域，分别位于第74~96位和第106~128位，具有两个胞质内结构域，分别位于第1~73位和第129~158位，具有一个胞质外结构域，位于第97~105位。由图3（b）~图3（d）可知，其他3种微藻LD蛋白均无跨膜结构域，但分别在N端和C端各具有一个嵌入膜内的区域。图3微藻LD蛋白的跨膜结构域10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F3a1（a）微拟球藻LDSP蛋白的跨膜结构域10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F3a2（b）巴夫杜氏藻MLDP蛋白的跨膜结构域10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F3a3（c）雨生红球藻HOGP蛋白的跨膜结构域10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F3a4（d）莱茵衣藻MLDP蛋白的跨膜结构域由图4（a）可知，微拟球藻LDSP蛋白的第一个跨膜结构域形成一个双亲性α螺旋，疏水面占比较大，亲水面仅含2个Ser和1个Ile，而第二个跨膜结构域形成的α螺旋完全疏水，说明该螺旋全部嵌入膜内。其他3种微藻LD蛋白均形成双亲性α螺旋嵌入膜内，巴夫杜氏藻MLDP蛋白N端双亲性α螺旋为亲水面，与疏水面占比相同。由图4（b）可知，C端的双亲性α螺旋为亲水面占比较大；由图4（c）可知，雨生红球藻HOGP蛋白N端和C端双亲性α螺旋均为亲水面占比较大；由图4（d）可知，莱茵衣藻MLDP蛋白N端的双亲性α螺旋为亲水面占比较大，C端的双亲性α螺旋为疏水面占比较大，表明莱茵衣藻MLDP蛋白嵌入膜内的程度介于微拟球藻LDSP蛋白和巴夫杜氏藻MLDP蛋白之间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F004图4微藻LD蛋白的双亲性α螺旋2.4微藻LD蛋白的二级结构、结构域和三级结构分析蛋白质二级结构是肽链的局部空间结构见图5，微藻LD蛋白的二级结构分析结果见表4。图5微藻LD蛋白的二级结构10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F5a1（a）微拟球藻LDSP蛋白的二级结构10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F5a2（b）巴夫杜氏藻MLDP蛋白的二级结构10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F5a3（c）雨生红球藻HOGP蛋白的二级结构由表4可知，与其他3种微藻LD蛋白相比，微拟球藻LDSP蛋白的α螺旋比例降低，延伸链、β转角和无规则卷曲比例升高，这可能与形成跨膜结构域有关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F5a4（d）莱茵衣藻MLDP蛋白的二级结构10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.T004表4微藻LD蛋白的二级结构组成项目微拟球藻LDSP蛋白巴夫杜氏藻MLDP蛋白雨生红球藻HOGP蛋白莱茵衣藻MLDP蛋白α螺旋比例43.0472.3977.8274.25延伸链比例18.352.361.822.24β转角比例4.431.682.552.99无规则卷曲比例34.1823.5717.8220.52%由图5（a）~图5（d）可知，微拟球藻LDSP蛋白、巴夫杜氏藻MLDP蛋白、雨生红球藻HOGP蛋白、莱茵衣藻MLDP蛋白均由α螺旋、延伸链、β转角和无规则卷曲组成。结构域是蛋白质中具有特异结构和独立功能的区域，是介于二级结构和三级结构之间的一个层次，微藻LD蛋白的结构域分析结果见图6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F006图6微藻LD蛋白的结构域分析由图6可知，微拟球藻LDSP蛋白的C端具有焦磷酸硫胺素中间结构域（middle domain of thiamine pyrophosphate），因此微拟球藻LDSP蛋白可能参与糖代谢。巴夫杜氏藻MLDP蛋白的C端、雨生红球藻HOGP蛋白和莱茵衣藻MLDP蛋白的N端与中央区具有橡胶延伸因子（REF）结构域，由于微藻含有藻胶，因此巴夫杜氏藻MLDP蛋白、雨生红球藻HOGP蛋白和莱茵衣藻MLDP蛋白可能参与藻胶合成。蛋白质在二级结构和结构域的基础上进一步盘绕、折叠，依靠次级键所形成的空间结构为三级结构，微藻LD蛋白的三级结构预测和评估结果见图7、表5。图7微藻LD蛋白的三级结构及拉式图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F7a1（a）微拟球藻LDSP蛋白的三级结构及拉式图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F7a2（b）巴夫杜氏藻MLDP蛋白的三级结构及拉式图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F7a3（c）雨生红球藻HOGP蛋白的三级结构及拉式图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F7a4（d）莱茵衣藻MLDP蛋白的三级结构及拉式图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.T005表5微藻LD蛋白的三级结构模型评估结果项目微拟球藻LDSP蛋白巴夫杜氏藻MLDP蛋白雨生红球藻HOGP蛋白莱茵衣藻MLDP蛋白允许区域91.091.698.897.9额外允许区域9.07.31.22.1最大允许区域01.100不允许区域0000%由图7（a）~图7（d）可知，微拟球藻LDSP蛋白、巴夫杜氏藻MLDP蛋白、雨生红球藻HOGP蛋白、莱茵衣藻MLDP蛋白分别具有5、9、10、11个α螺旋束，延伸链、β转角和无规则卷曲组成连接区域，微拟球藻LDSP蛋白折叠成漏斗状，其他3个蛋白质折叠成哑铃状。由图7拉式图谱和表5可知，微拟球藻LDSP蛋白、巴夫杜氏藻MLDP蛋白、雨生红球藻HOGP蛋白、莱茵衣藻MLDP蛋白分别有100.0%、98.9%、100.0%、100.0%的氨基酸残基在允许区域或额外允许区域，因此预测模型合理性较高。2.5微藻LD蛋白的保守基序分析（见图8）基序是蛋白质中的保守序列，体现蛋白质的生物学功能。由图8可知，结合微拟球藻LDSP蛋白的结构信息，微藻LD蛋白的多序列比对注释结果发现微拟球藻LDSP蛋白C端的第8个α螺旋的序列在微藻LD蛋白中高度保守，该基序符合正则表达式：P[IL]X(3)V[VA]XPA[IL]XK[VI]X(2)，位于微藻LD蛋白的C端。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F008图8微藻LD蛋白的保守基序分析2.6微藻LD蛋白的磷酸化位点分析蛋白质磷酸化发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的残基上，微藻LD蛋白的磷酸化位点分析结果见表6、图9。去除得分接近阈值0.5的位点后。由图9（a）~图9（d）、表6可知，微拟球藻LDSP蛋白、巴夫杜氏藻MLDP蛋白、雨生红球藻HOGP蛋白、莱茵衣藻MLDP蛋白分别具有9、33、24、22个磷酸化位点。微拟球藻LDSP蛋白的磷酸化位点最少，表明其活性和定位的调控机制发生改变，除磷酸化外，可能存在其他类型的翻译后修饰或蛋白质相互作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.T006表6微藻LD蛋白的磷酸化位点分析项目微拟球藻LDSP蛋白巴夫杜氏藻MLDP蛋白雨生红球藻HOGP蛋白莱茵衣藻MLDP蛋白合计9332422Ser2171211Thr71496Tyr0235个图9微藻LD蛋白的磷酸化位点10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F9a1（a）微拟球藻LDSP蛋白的磷酸化位点10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F9a2（b）巴夫杜氏藻MLDP蛋白的磷酸化位点10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F9a3（c）雨生红球藻HOGP蛋白的磷酸化位点10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.017.F9a4（d）莱茵衣藻MLDP蛋白的磷酸化位点3讨论为适应市场对鱼类不断增长的需求，提高鱼类成活率和抵抗力以增加鱼类产量至关重要。微藻营养丰富，富含蛋白质、脂质、糖类、矿物质，还含有色素、抗氧化物质等活性物质，已广泛在鱼类养殖中应用。微藻可以促进幼鱼生长、提高存活率，比人工饵料更具优势[16-18]。微拟球藻是真眼点藻纲的单细胞微藻，光合效率高、生长速度快，脂质含量可达37%~60%，且富含多不饱和脂肪酸[19-21]，可以为鱼体提供充足的能量，减少脂质累积，是幼鱼的优质饵料，已成为最具潜力的产油模式藻种。巴夫杜氏藻、雨生红球藻、莱茵衣藻也可以积累脂质，是微藻脂质的理想原料[22-24]。LD蛋白质组学研究发现，微拟球藻、巴夫杜氏藻、雨生红球藻、莱茵衣藻的主要LD蛋白，且已被验证可以调控脂质的累积[12-15]，因此微藻LD蛋白参与微藻脂质代谢调控，是提高微藻脂质产量的重要靶标。微藻LD蛋白理化性质的差异与亲缘关系分析结果相符，微拟球藻LDSP蛋白与哺乳动物LD蛋白的亲缘关系较近，而与其他3个微藻LD蛋白亲缘关系较远[25]，因此微拟球藻LDSP蛋白的功能可能与其他微藻LD蛋白不同。微拟球藻LDSP蛋白和莱茵衣藻MLDP蛋白的C端具有2个跨膜结构域，且一个形成疏水面占比较大的双亲性α螺旋，另一个则是疏水性α螺旋，表明微拟球藻LDSP蛋白直接以2个α螺旋插入膜中，是稳定的LD常驻蛋白[26]，巴夫杜氏藻MLDP蛋白、雨生红球藻HOGP蛋白和莱茵衣藻MLDP蛋白均无跨膜结构域，但N端和C端各存在一个双亲性α螺旋嵌入膜内，其中莱茵衣藻MLDP蛋白的双亲性α螺旋疏水面较大，嵌入膜内较深，表明其在向LD常驻蛋白进化。微拟球藻LDSP蛋白的二级结构、结构域和三级结构均与其他3个微藻LD蛋白差异较大，可能参与糖脂代谢，这可能是微拟球藻可以大量积累脂质的原因之一。与细菌LD蛋白类似，微藻LD蛋白的C端也存在一个保守基序，该基序未形成双亲性α螺旋，疏水性较弱，因此并不与膜相互作用，而是游离在细胞质中。除蓝藻外，其他微藻已经具有细胞核，该基序可能并不与DNA结合，但需要试验验证[27]。微拟球藻LDSP蛋白的磷酸化位点低于其他微藻LD蛋白，可能是进化的结果，表明尽管磷酸化是蛋白质活性和定位的重要调控机制之一，随着细胞的生物膜系统、遗传信息传递与表达系统、细胞骨架系统的完善，蛋白质活性与定位的调控机制也越来越复杂，不再单一依赖于磷酸化修饰。4结论本试验表明，微藻LD蛋白以α螺旋定位于LD表面，其活性或定位可能受激酶调控，逐渐向LD常驻蛋白进化，参与糖脂代谢的调控。