近年来，我国畜牧业处于高速发展阶段，农业技术也愈发先进[1]，人工种植的牧草在反刍动物的日粮中应用也越来越广泛。西藏地处我国青藏高原，海拔较高、平均气温相对较低。高寒强紫外的自然环境使西藏地区的牧草生长期较短，产量较低，导致青绿饲料并非一年四季均具有足够的供应。饲草料资源短缺严重制约西藏地区畜牧业的发展[2]。因此，开发和扩大饲草料资源对西藏畜牧业的发展具有重要意义。青贮是饲料生产中常用的一种加工方法[3]，将青绿饲料置于密封的厌氧环境中，利用乳酸菌等微生物发酵为适口好的青贮饲料[4]。青绿饲料在青贮发酵后可以降低营养物质的流失，延长保质期，提高草食动物对青绿饲料中营养物质的利用[5]。巨菌草（Pennisetum giganteum）是一种优质型牧草，属多年生禾本科作物，是一种菌草[6]，具有生长速度快、繁殖性能强、营养价值高、抗逆性强等优良特性。巨菌草在维持生态环境、畜牧业发展以及能源开发利用等方面具有巨大潜力[7-8]，可开发成为饲草料资源。经调查发现，西藏有诸多地区种植了巨菌草，且当地还通过铺设黑色地膜、搭设简易大棚等方式保证巨菌草的正常生长[9-10]，为西藏巨菌草饲料资源的开发提供了参考。但由于巨菌草中的可溶性碳水化合物的含量较少，不利于其常规青贮发酵进行[11]，提高巨菌草青贮饲料的发酵品质成为研究重点。本试验在巨菌草中添加可溶性碳水化合物含量较多的玉米粉进行混合青贮，探究添加不同比例的玉米粉对巨菌草青贮发酵品质和微生物多样性的影响，为巨菌草青贮饲料的制作提供参考。1材料与方法1.1试验材料巨菌草采自西藏农牧学院草业实习基地，于2021年7月在成熟期进行刈割。玉米使用114b摇摆式粉碎机粉碎，过20目筛。1.2试验设计试验采用完全随机设计，共设置4个巨菌草青贮组，每组5个重复，分别在巨菌草中添加0（A组）、5%（B组）、10%（C组）、15%玉米粉青贮（D组），在实验室小型青贮罐中进行青贮。1.3测定指标及方法1.3.1青贮饲料的制作将巨菌草切割成2~3 cm的小段，按照1.2比例加入玉米粉并充分混匀，置于250 mL的青贮罐内压实，25 ℃青贮发酵60 d后，取出全部青贮饲料混匀后进行分析。1.3.2青贮饲料感官鉴定（见表1）选用德国农业协会（DLG）所推荐的等级评分标准[12]对巨菌草青贮饲料的气味、质地以及色泽进行感官评定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.018.T001表1青贮饲料的感官评测标准项目评分标准评分气味无臭味，具有明显的酸香味14具有微弱的臭味，也具有较为明显的酸香味10具有明显的臭味，也具有微弱的酸香味4具有很强的臭味，几乎不具有酸香味2质地茎叶保存完整且良好4茎叶保存较差2茎叶保存非常差，有污染和发霉的情况1茎叶腐烂严重，污染严重0色泽与青贮前色泽相似2与青贮前相比略微变色1与青贮前相比明显变色0等级1级（优等）16~202级（尚好）10~153级（中等）5~94级（腐败）0~41.3.3青贮饲料发酵品质测定每个试验组分别取样品500 g置于120 ℃的烘干箱中烘20 min，将样品置于65 ℃烘干箱中烘48 h，直至恒重，测定初水分含量。烘干后使用114b摇摆式粉碎机粉碎样品，测定干物质含量[13]；采用杜马斯燃烧定氮法测定粗蛋白质含量[13]；采用索氏浸提法测定粗脂肪含量[13]；使用全自动纤维分析仪测定粗纤维含量[13]；采用灼烧法测定粗灰分含量[13]，每个试验组各取20 g样品置于烧杯中，加入80 mL蒸馏水，倒入组织粉碎机粉碎搅拌1 min，将混合液过滤，使用pH值测定仪测定滤液的pH值。1.3.4青贮饲料微生物多样性分析青贮结束时，采集青贮饲料样品于5 mL冻存管中，液氮中速冻，于-80 ℃超低温冰箱中保存。将青贮饲料样品用干冰保存送至上海派森诺生物技术有限公司进行菌群结构测定。利用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒提取青贮饲料样品的总DNA，以提取的DNA为模板，使用引物5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和引物5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'进行PCR扩增，并对扩增产物进行检测和回收。制备测序文库，并对测序文库进行纯化、质检和定量，使用PacBio Sequel Ⅱ测序仪对测序文库进行双端测序，并对测序数据进行分析。1.4数据统计与分析采用Vsearch软件对获得的序列进行聚类分析，按照97%的相似度对序列进行操作分类单元划分（OTUs），将OTU与Greengenes数据库相比对，获得分类学分析，利用多种Alpha多样性指数（Chao1指数、Observed_species指数、Shannon指数和Simpson指数）评估菌群结构的丰富度和均匀度；通过主坐标分析（PCoA）考察各样本间的多样性差异。试验数据采用Excel进行整理，SPSS 23.0进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05为差异显著。2结果与分析2.1不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料感官品质的影响（见表2）由表2可知，巨菌草单独青贮组略有轻微的丁酸味，但茎叶保持完整，色泽与青贮前一致，感官评定判定为尚好。B组、C组、D组巨菌草青贮均具有明显的青贮酸香味，样品的茎叶均保存完整且良好，色泽均与青贮前相似，感官评定均判定为优等。研究表明，添加一定量的玉米粉巨菌草青贮可改善青贮饲料的感官品质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.018.T002表2不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料感官品质的影响组别气味质地色泽等级等级A组1131.02尚好B组1331.51优等C组1231.01优等D组1231.01优等2.2不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料发酵品质的影响（见表3）由表3可知，巨菌草青贮饲料的初水分、干物质、粗蛋白、粗脂肪的含量和pH值差异不显著（P0.05）。与A组相比，B组、C组、D组巨菌草青贮的粗纤维和粗灰分的含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.018.T003表3不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料发酵品质的影响组别初水分/%粗蛋白/%干物质/%粗脂肪/%粗纤维/%粗灰分/%pH值A组54.39±0.678.83±0.2941.61±0.311.40±1.0642.37±6.39a5.43±0.69a4.08±0.15B组58.47±0.368.47±0.1739.50±0.321.52±0.3338.07±0.56b4.72±0.17b3.79±0.24C组55.97±0.378.44±0.2942.42±0.271.73±0.6335.19±1.82c4.11±0.67c3.84±0.31D组55.68±0.678.75±0.1442.15±0.672.10±0.5932.19±0.27d4.10±0.05c3.76±0.12注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.3不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料微生物多样性的影响2.3.1测序结果及细菌菌群结构多样性分析（见图1、表4、图2）由图1可知，本研究对4个青贮组细菌菌群的V3~V4高变异区进行测序，并对获得的OTUs在门、纲、目、科、属等5个分类水平上进行鉴定，共鉴定得到24个门、53个纲、129个目、237个科和547个属。A组鉴定得到15个门、31个纲、58个目、101个科和204个属，B组鉴定得到18个门、42个纲、102个目、185个科和357个属，C组鉴定得到20个门、34个纲、72个目、126个科和274个属，D组鉴定得到20个门、35个纲、76个目、134个科和277个属。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.018.F001图1各分类水平的细菌类群OTU数量由表4可知，B组、C组和D组的Chao1指数和Observed species指数显著高于A组（P0.05），表明巨菌草青贮中添加玉米粉会影响青贮饲料细菌菌群的表征丰富度。4个青贮组的Shannon指数分别为3.34、3.17、3.40、3.39，Simpson指数分别为0.78、0.70、0.72、0.71。各试验组巨菌草青贮饲料Shannon指数和Simpson指数差异不显著（P0.05），表明巨菌草青贮中添加玉米粉对青贮饲料细菌菌群的表征多样性无显著影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.018.T004表4不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料Alpha多样性的影响组别Chao1指数Observed_species指数Shannon指数Simpson指数A组263.30±19.98c234.43±10.79c3.34±0.270.78±0.02B组374.81±50.56b319.25±37.75b3.17±0.490.70±0.10C组496.72±94.91a430.47±82.66a3.40±0.650.72±0.09D组428.91±34.48ab365.58±35.74ab3.39±0.570.71±0.11由图2可知，不同青贮组中微生物群落聚集在不同的区域内，A组聚集在图中的下半区域，B组、C组、D组聚集在图中的上半区域，表明巨菌草青贮饲料添加玉米粉会改变发酵饲料的细菌菌群结构。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.018.F002图2不同比例玉米粉与巨菌草青贮样品菌群PCoA分析2.3.2不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料细菌菌群结构组成的影响（见图3、图4）由图3可知，在门分类水平上，20个青贮饲料样品中共鉴定出10个细菌菌门，其中5个菌门的相对丰度大于0.1%，依次为厚壁菌门（Firmicutes）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）；各组厚壁菌门的相对丰度分别为87.79%、92.39%、95.13%、94.90%，蓝细菌门的相对丰度分别为9.81%、2.20%、1.30%和2.90%，为巨菌草青贮饲料的主要细菌菌门。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.018.F003图3门水平下各青贮组中细菌菌群组成由图4可知，在属分类水平上，魏斯氏菌属（Weissella）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、叶绿体属（Chloroplast）、片球菌属（Pediococcus）、线粒体属（Mitochondria）和别样棒菌属（Allobaculum）是巨菌草青贮饲料的优势菌属。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.018.F004图4属水平下各青贮组中细菌菌群组成2.3.3不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料细菌菌群差异的影响（见表5、表6）由表5可知，在门水平上，C组和D组中巨菌草青贮饲料的厚壁菌门相对丰度显著高于A组（P0.05），B组、C组和D组巨菌草青贮的蓝细菌门相对丰度显著低于A组（P0.05）；B组巨菌草青贮的变形菌门相对丰度显著高于其他组，D组巨菌草青贮的拟杆菌门相对丰度显著低于C组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.018.T005表5不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料细菌门水平相对丰度的影响组别厚壁菌门蓝细菌门变形菌门拟杆菌门放线菌门A组87.79±6.29b9.81±5.84a0.95±0.68b0.98±0.86ab0.31±0.17B组92.39±2.39ab2.20±1.50b4.50±2.53a0.44±0.39ab0.29±0.28C组95.13±2.17a1.30±1.13b1.58±0.75b1.63±1.49a0.22±0.16D组94.90±3.35a2.90±1.93b1.58±0.68b0.25±0.22b0.28±0.07%由表6可知，在属分类水平上，C组巨菌草青贮魏斯氏菌属的相对丰度显著低于在A组（P0.05）；B组、C组巨菌草青贮中乳酸杆菌属的相对丰度高于A组（P0.05）；B组、C组、D组巨菌草青贮明串珠菌属的相对丰度显著高于A组（P0.05），叶绿体属和别样棒菌属的相对丰度显著低于A组（P0.05）；B组巨菌草青贮线粒体属的相对丰度显著高于A组、C组和D组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.018.T006表6不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料细菌属水平相对丰度的影响组别魏斯氏菌属乳酸杆菌属明串珠菌属叶绿体属片球菌属线粒体属别样棒菌属A组44.14±6.95ab29.81±5.81ab9.69±3.11b9.80±3.23a0.68±0.47ab0.12±0.04b0.36±0.20aB组30.31±7.10b34.41±14.65ab26.32±9.07a2.20±1.00b0.56±0.40ab2.65±1.12a0.11±0.04bC组13.38±4.98c49.23±11.78a29.20±12.56a1.49±0.57b1.08±0.37a0.26±0.16b0.10±0.03bD组52.28±13.28a17.21±6.71b22.28±8.33a1.50±0.53b0.21±0.10b0.21±0.09b0.06±0.05b%3讨论饲草料资源短缺，严重制约了西藏畜牧业的发展，开发优质饲草料资源对西藏畜牧业的发展具有重要意义[6]。巨菌草植株叶片宽大且根茎粗壮发达[14]，具有生长速度快、繁殖性能好、抗逆性强等优良特性，可在西藏地区种植。但由于巨菌草碳水化合物含量不高，单独青贮效果不佳，探究如何改善巨菌草青贮饲料的品质对开发巨菌草青贮饲料至关重要。本研究在巨菌草青贮饲料中添加不同比例的玉米粉，分析玉米粉对巨菌草青贮饲料感官品质、发酵品质和菌群结构的影响。3.1不同比例玉米粉对巨菌草青贮感官品质的影响研究表明，添加玉米粉可以改变巨菌草青贮饲料的气味，明显提高巨菌草青贮的感官品质，与续元申等[15]得出杞柳皮青贮中添加5%玉米粉可改善其感官鉴定评价和张晓庆等[16]得出麻叶荨麻青贮中添加一定量玉米粉可提高青贮饲料品质和费氏评分的结论一致。因此，添加玉米粉有利于巨菌草青贮饲料的发酵。3.2不同比例玉米粉对巨菌草青贮发酵品质的影响本研究表明，添加玉米粉明显降低了巨菌草青贮的粗纤维含量，可能是因为添加玉米粉与巨菌草的总氮比例达到最合适的水平，促进了微生物的生长繁殖，消耗了粗纤维，与牟爱生等[17]对木薯叶青贮饲料研究结果相似。本研究中，各组青贮饲料的pH值均在4.2以下，添加玉米粉处理组巨菌草青贮的pH值在一定程度上低于无玉米粉处理组，可能是因为玉米粉中的碳水化合物使青贮过程进行更顺利。粗纤维含量降低能够提升饲料的适口性，增加动物的采食量，而pH值是衡量青贮质量优劣的评估标准之一[18]，较低的pH值有利于青贮发酵的进行，能够防止青贮过程中霉变的发生。一般青贮后pH值低于4.2能够作为青贮成功的标准[19]，因此，加入玉米粉能提高巨菌草青贮的发酵品质。3.3不同比例玉米粉对巨菌草青贮微生物多样性的影响青贮是一个非常复杂的微生物活动的过程，青贮过程中微生物菌群的变化会对青贮饲料的发酵品质产生很多影响。因此，深入了解青贮过程中微生物多样性的变化有助于分析青贮饲料的营养物质变化情况[20]。本研究中，不同青贮组微生物多样性指数不同，表明巨菌草青贮中添加玉米粉会改变其菌群结构的组成。本研究发现，巨菌草青贮饲料的优势菌门为中共检测到24个门，优势菌门为厚壁菌门、蓝藻菌门和变形菌门，优势菌属为魏斯氏菌属、乳酸杆菌属和明串珠菌属，与朱见深等[21]得出乳杆菌属、克雷伯菌属及魏斯氏菌属为青贮玉米的优势菌属和周俊华等[22]得出乳杆菌属、醋酸杆菌属和芽孢杆菌属是青贮甘蔗尾叶的优势菌属的结果不同，表明农作物的种类不同，其青贮发酵过程中微生物的变化不同。本研究发现，添加玉米粉可以提高巨菌草青贮饲料中厚壁菌门的相对丰度，降低蓝细菌门的相对丰度。厚壁菌门[23]具有促进纤维素分解的作用，表明巨菌草青贮饲料中添加玉米粉可以降低其纤维成分的含量。本研究还发现，巨菌草青贮饲料中添加玉米粉可以提高青贮饲料中常见的乳酸菌菌种的相对丰度，如乳杆菌属和明串珠菌属，加强了产生乳酸的能力，抑制了有害杂菌的生长。4结论本研究结果表明，添加玉米粉与巨菌草混合青贮更有利于青贮进行，巨菌草青贮饲料中添加玉米粉可以改善青贮饲料的感官品质和粗纤维含量，提高乳酸菌菌种的丰度。