植物提取物饲料添加剂具有抗氧化、抗菌及增强免疫等功效，逐渐成为替抗添加剂的主要类型之一，在畜禽绿色养殖等方面具有重要作用[1-4]。苦木（Picrasma quassioides）是苦木科苦树属植物[5]，具抑菌抗炎、抗氧化功能，可作为饲料添加剂使用[6]。研究表明，苦木加入肉牛饲粮中能够提高肉牛饲料利用率[7]；苦木饲粮组仔猪日增重、腹泻频率均优于土霉素钙组和维吉尼亚霉素组[8]。《中国兽药典》记载苦木具清热、祛湿、解毒功效，可用于治疗畜禽风热感冒、腹泻下痢等[9]。在兽医临床上，苦木具有改善猪生长性能、预防保育猪腹泻[10]、改善动物消化性能、提高免疫力、预防仔猪腹泻等作用[11]。关于苦木药用部位的记载和实际应用方法较为复杂[12-13]，多部典籍记载苦木的根、根皮、木材（去皮茎木）、茎皮、叶乃至花、果全株均可作为药材使用，且不同部位用量标准存在差异[12-15]。虽然苦木资源利用部位及其用量记载多样，但各药用部位的总生物碱含量，以及部分生物碱单体含量的变化规律等资料尚不完整，比如仅检索到苦木茎、枝的总生物碱含量的报告[16]，缺乏根皮、茎皮、果实等部位部分生物碱单体含量报道数据[17-18]。因此，本研究选择苦木现行标准中的限量指标成分[13,19]，即总生物碱、苦木碱己和苦木碱丁为定量测定指标，比较分析苦木主根（主根皮部、主根边材、主根心材）、侧根（侧根皮部、侧根木材）、须根、茎（茎皮部、茎边材、茎心材）、侧枝（侧枝皮部、侧枝木材）、叶、雄花、果共14个部位中总生物碱、苦木碱己和苦木碱丁含量，从而探究苦木各部位中3种成分的变化规律，以期为苦木资源的合理使用提供参考。1材料与方法1.1试验材料苦木采集自广西河池市东兰县石山区，经广西药用植物园彭玉德高级工程师鉴定为苦木科苦树属植物苦木（Picrasma quassioides），其中雄花在2021年4月采收，根、侧根、须根、茎（树干）、枝（侧枝）、叶于2021年6月采收自同一株系，同一时间地点不同株系采收果实。采收后及时分为皮部（树皮）、木材，木材中有心材的分出心材。共分出茎皮部、茎边材、茎心材，枝皮部、枝木材，主根皮部、主根边材、主根心材，侧根皮部、侧根木材，须根、雄花、果、叶共14个部位；枝为3年生的木质化硬枝，阴干冻藏。1.2仪器与试剂Agilent 1260型高效液相色谱仪（DAD检测器，Agilent Chemstation化学工作站）、KQ5200DE数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）、Sartorius电子分析天平（德国赛多利斯公司）、Milli-Q型超纯水机（美国Millipore公司）、101-1B电热恒温鼓风干燥箱（绍兴市易诚仪器制造有限公司）、UV-5100B紫外分光光度仪（上海精密科学仪器有限公司）、HH-4数显恒温水浴锅（金坛区西城新瑞仪器厂）、SHB-Ш循环水多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、RZ01C旋转蒸发器（郑州长城科工贸有限公司）、pH-25型pH计（上海越平科学仪器有限公司）。苦木碱己（4-甲氧基-5-羟基铁屎米酮，简称苦木酮或苦木碱F）对照品购自四川省维克奇生物科技有限公司（批号为：wkq20101401，含量≥98%），苦木碱丁（4，5-二甲氧基铁屎米酮，简称苦木碱D）对照品购自四川省维克奇生物科技有限公司（批号为：wkq20101005，含量≥98%），水为自制超纯水，乙腈为色谱纯。1.3苦木不同部位的2种生物碱单体含量测定1.3.1对照品溶液的制备生物碱单体定量分析的具体方法参考文献[18]进行。精密称取苦木碱己6.64 mg，加甲醇定容至10 mL制成650.72 mg/L苦木碱己储备液；精密称取苦木碱丁6.60 mg，加入甲醇定容至50 mL制成12.936 mg/L苦木碱丁储备液。分别精密量取苦木碱己（650.72 mg/L）、苦木碱丁（12.936 mg/L）各1 mL，置于100 mL容量瓶，加甲醇至刻度，配制成含苦木碱己浓度为6.507 2 mg/L，苦木碱丁浓度为1.293 6 mg/L的混合对照品溶液，4 ℃条件下冷藏备用。1.3.2色谱条件Kromasil 100-5 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈（A）-乙酸铵（B，质量浓度为25 mmol/L，冰乙酸调节pH值为4.0）为流动相，采用梯度洗脱（0~6 min，15.0%~19.5% A；6~7 min，19.5%~22.5% A；7~14 min，22.5%~23.0% A；14~20 min，23.0%~30.0% A；20~25 min，30.0%~40.0% A；25~40 min，40.0%~50.0% A），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长254 nm，进样量10 μL。在此条件下，苦木混合标准品和药材中各色谱峰分离良好，见图1。图1苦木对照品及苦木药材高效液相色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.015.F1a1（a）苦木对照品10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.015.F1a2（b）苦木药材1.3.3供试品溶液的制备方法精密称取苦木各不同部位粉末0.5 g（过三号筛），置于具塞锥形瓶中，精密加入85%乙醇25 mL，超声处理30 min，放冷后补重，摇匀，过滤，取续滤液，使用0.45 nm微孔滤膜（PTFE）过滤。1.4苦木不同部位的总生物碱含量测定1.4.1对照品溶液的制备苦木总生物碱含量测定方法参考文献[16]进行。取苦木碱己对照品适量，精密称定，置于100 mL容量瓶中，加80%乙醇制成质量浓度为0.1 g/L溶液。精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中，加入2%盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，以2%盐酸溶液为空白，采用紫外-可见分光光度法在318 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标（y），质量浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，得回归方程y=15.786x+0.007 1，R=0.995 5，表明对照品在0.004~0.02 g/L范围内与吸光度线性关系良好。1.4.2供试品溶液的制备方法精密称取过四号筛的不同部位的苦木粉末各0.5 g，使用滤纸包好，置于索氏提取器中，提取管规格为250 mL，10个样品一批，使用300 mL石油醚回流提取1.5 h去除色素；将苦木粉末置于具塞锥形瓶中，加80%乙醇25 mL，超声提取60 min，放冷，补重，摇匀，过滤，取10 mL滤液于蒸发皿中；40 ℃水浴蒸干，使用5 mL 2%盐酸溶液分3次溶解提取物，转移至10 mL量瓶中超声10 min，溶解，加2%盐酸溶液稀释至刻度摇匀，过滤，精密移取滤液1 mL，置于5 mL容量瓶中，加入2%盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。1.4.3总生物碱含量吸取1.4.2项下各供试品溶液3 mL于比色皿中，以2%盐酸溶液为空白，于318 nm处测定吸光度，每组3个重复，代入标准曲线方程中计算总生物碱含量。1.5数据统计与分析采用WPS办公软件进行制表作图，SPSS 25.0软件进行差异显著性分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1苦木不同部位的2种生物碱单体含量比较（见表1）由表1可知，苦木各部位苦木碱已含量差异大，14个不同部位的苦木碱已含量为0.015 4~3.825 8 mg/g，最高值与最低值相差约248倍；平均值为0.398 1 mg/g，只有茎心材和主根心材2个部位高于平均值，而其余12个部位均低于平均值。各部位苦木碱己含量排序为茎心材主根心材枝皮部枝木材茎边材茎皮部主根边材主根皮部叶须根侧根皮部雄花果侧根木材。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.015.T001表1苦木不同部位苦木碱己和苦木碱丁含量比较项目编号苦木碱己苦木碱丁主根皮部10.037 8±0.000 50.476 8±0.000 2边材20.058 5±0.000 40.327 4±0.000 0心材31.084 5±0.105 40.550 9±0.000 7侧根皮部40.018 1±0.000 60.028 0±0.001 8木材50.015 4±0.000 20.025 8±0.000 7茎皮部60.061 9±0.000 30.189 4±0.000 3边材70.075 6±0.000 30.204 8±0.002 1心材83.825 8±0.189 20.831 6±0.068 8枝皮部90.167 0±0.002 50.091 7±0.000 1木材100.142 3±0.003 10.081 4±0.000 1其他须根110.024 5±0.000 70.027 2±0.000 7叶120.028 3±0.000 10.027 6±0.000 5雄花130.017 2±0.000 20.006 6±0.000 0果140.015 8±0.000 40.009 1±0.000 2mg/g苦木14个部位的苦木碱丁含量为0.006 6~0.831 6 mg/g，最高值与最低值之间相差126倍；平均值为0.205 6 mg/g，其中茎心材、主根心材、主根皮和主根边材中的苦木碱丁含量高于平均值，其余10个部位均低于平均值。各部位苦木碱丁含量排序为茎心材主根心材主根皮部主根边材茎边材茎皮部枝皮部枝木材侧根皮部叶须根侧根木材果雄花。2.2苦木不同部位中总生物碱含量测定比较（见图2）由图2可知，14个不同部位的总生物碱含量范围为3.070 8~22.175 2 mg/g，最高值与最低值间相差约7.2倍；平均值为8.620 5 mg/g，其中茎心材、叶、主根心材、茎皮部、主根皮部共5个部位高于平均值，其余9个部位低于平均值。各部位总生物碱含量由大到小依次为茎心材叶主根心材茎皮部主根皮部侧根皮部枝皮部茎边材主根边材侧根木材枝木材须根雄花果；各部位总生物碱含量分别为22.175 2、21.610 4、15.740 2、9.843 5、8.769 5、6.644 6、6.126 1、6.053 4、5.161 2、4.960 6、4.005 1、3.340 5、3.186 6、3.070 8 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.015.F002图2苦木不同部位总生物碱含量注：不同字母表示差异显著（P0.05）。茎心材和叶之间差异不显著，但二者均显著高于其余12个部位；主根心材显著高于其余11个部位；茎皮部显著高于其余10个部位；主根皮部显著高于其余9个部位；侧根皮部显著高于其余8个部位；枝皮部与茎边材差异不显著，但二者显著高于其余6个部位；主根边材与侧根木材差异不显著但显著高于其余4个部位；须根、雄花和果3个部位差异不显著，但显著低于枝木材。2.3苦木不同部位的聚类分析（见图3）运用SPSS 25.0数据处理软件，采用2种生物碱单体和总生物碱含量对苦木不同部位进行聚类分析，首先使用沃德（Ward）聚类结合欧式距离系数法得到系统聚类结果，在此基础上再用K-均值法（快速聚类法）拟定分为5类作聚类分析。由图3可知，雄花、果、须根、侧根皮、侧根木材、枝皮、枝木材7个部位归为Ⅰ类，主根边材、主根皮、茎边材、茎皮4个部位归为Ⅱ类，主根心材为Ⅲ类，叶为Ⅳ类，茎心材为Ⅴ类。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.015.F003图3苦木不同部位聚类分析3讨论邓贵华[20]研究广东、广西出产的14个批次苦木药材发现，不同部位中苦木碱丁含量变化较大，在茎中该成分含量较高，在叶、嫩枝、花和细根中含量较低。吕武清等[21]报道，江西、广东产12个批次苦木药材中2个批次细枝和2个批次叶中均未检出苦木碱丁，但在茎中该成分含量较高。本研究中，苦木碱丁在苦木叶、花、果、须根、侧根皮部、侧根木材、枝皮部和枝木材8个部位中含量极低，在主根（皮部、边材、心材）和茎（皮部、边材、心材）的6个部位中含量较高与邓贵华[20]、吕武清等[21]的研究结论一致。苦木不同部位的苦木碱己含量在相关报道中差异较大，如在两广地区产的14个批次苦木中发现其中4个批次黄色心材茎中苦木碱己含量为0.542~4.382 mg/g；4个批次无心材茎中苦木碱己含量为0.003~1.711 mg/g；2个批次苦木叶中苦木碱己含量分别为0.016 mg/g、未检出；2个批次嫩枝中苦木碱己含量分别为0.002、0.182 mg/g；1个批次苦木根中苦木碱己含量为0.312 mg/g[21]。本研究苦木碱己含量在苦木根心材、茎心材中较高，在包括叶在内的其他部位中含量较低，与邓贵华[20]的研究结果相似。刘明颖等[16]发现，20批次苦木茎中总生物碱含量变动为2.8~9.5 mg/g，10批次粗枝中总生物碱含量变动为1.4~2.3 mg/g。刘伟等[22]报道，苦木中总生物碱含量为17.75 mg/g。李乔等[23]研究发现，9批次苦木总生物碱含量为3.25~9.49 mg/g，平均值为5.36 mg/g。据《江西省中药材标准》（2014）苦木项下载明苦木总生物碱限量标准为不少于0.05%（0.5 mg/g）[19]。本研究表明，苦木不同部位总生物碱含量存在较大差异，变化幅度为3.070 8~22.175 2 mg/g，以心材、叶、树皮中含量为高，各部位总生物碱含量均高于江西省中药材标准。苦木茎心材目前与茎、枝混合使用，从本试验结果及前人报道分析，建议将茎心材、主根心材2个部位分开使用，且用量应与枝有所差别；而茎皮、茎边材、主根皮、主根边材4个部位也建议在药材初加工时予以分开，且设置不同用量标准。4结论本研究表明，苦木不同部位的苦木碱己、苦木碱丁、总生物碱含量差异较大，对苦木不同药用部位的用量标准设置和统货混合使用具有借鉴意义，可为苦木不同部位资源在畜牧业的开发利用提供参考。