双歧杆菌是动物肠道中重要的益生菌，根据肠道生理条件的变化呈不规则弯曲杆状[1]，表面富含肽聚糖[2]、脂磷壁酸[3]及细胞壁蛋白质[4]等活性成分，可阻碍其他病原微生物与宿主细胞结合以保护宿主[5]。双歧杆菌分泌的生物素、多糖和酶等物质可调节宿主机体免疫和消化功能，在畜禽生产中具有较高的应用研究价值[6]。益生菌能够提高鸡的生长性能和健康水平[7]，但目前仍缺少双歧杆菌对肉鸡生长性能的报道。本试验在肉鸡日粮中添加不同水平的双歧杆菌，以观察其对肉鸡生长性能、血清生化指标及肠道形态的影响，为双歧杆菌在肉鸡养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料及地点双歧杆菌制剂由山东苏柯汉生物工程股份有限公司生产，活菌数为1×109 CFU/g。试验于周口市先锋肉鸡养殖专业合作社进行。1.2试验设计与饲养管理选取10 000只AA肉鸡，随机分为4组，每组5个重复，每个重复500只鸡。对照组肉鸡饲喂基础日粮，试验组分别在基础日粮中添加500、750、1 000 mg/kg双歧杆菌，基础日粮组成与营养水平见表1。试验期42 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.008.T001表1基础日粮组成与营养水平项目1~21 d22~42 d原料组成/%玉米55.4853.16豆粕28.1626.27鱼粉2.501.80面粉3.425.45大豆油2.242.16麦麸6.189.06石粉0.080.16食盐0.300.30磷酸氢钙0.100.10L-赖氨酸盐酸盐0.250.25DL-蛋氨酸0.290.29预混料1.001.00合计100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)11.8712.06粗蛋白质/%22.4319.46钙/%0.860.88磷/%0.450.44赖氨酸/%1.341.10蛋氨酸+半胱氨酸/%0.980.89色氨酸%0.340.21苏氨酸%0.840.63注：1.预混料为每千克日粮提供：VD3 2 050 IU、VA 2 500 IU、VK3 1.43 mg、VE 20 IU、烟酸9.84 mg、泛酸14.32 mg、叶酸5.73 mg、生物素0.18 mg、VB1 4.63 mg、VB2 3.72 mg、VB12 0.05 mg、Cu 6.65 mg、Fe 82.31 mg、Zn 43.57 mg、I 0.3 mg、Se 0.2 mg、Mn 34.15 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。在正式试验前1周对试验场地进行消毒和干燥。试验期间保证试验肉鸡采食和饮水充足，舍内合理通风。鸡的免疫、治疗与日常保健参考养殖场的规章制度。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能试验第1、21、42 d试验鸡空腹称重，记为初重和末重，每日记录投料量和剩余饲料量，统计试验阶段采食量，计算试验鸡的平均日增重、平均日采食量、料重比。平均日增重=(末重-初重)/(试验天数×试验鸡数)(1)平均日采食量=总采食量/(试验天数×试验鸡数)(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.3.2血清免疫和抗氧化指标试验第42 d，每个重复随机选择2只试验鸡，翅静脉采血约5 mL，3 000 r/min离心15 min，上清液保存于无菌无酶离心管中，置于-20 ℃冰箱保存。血清生化指标测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，各项指标的测定操作步骤参考试剂盒说明书。血清免疫指标包括：免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）及白细胞介素-10（IL-10）。血清抗氧化指标包括：总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）。1.3.3肠道形态指标采血结束，试验鸡放血致死，分别剪取十二指肠、空肠和回肠约2 cm，经生理盐水清洗，使用4%多聚甲醛进行固定保存24 h。通过NIS-Elements D显微图像分析软件分析肠绒毛高度（VH）和隐窝深度（CD），并计算绒毛高度/隐窝深度（V/C）值。1.3.4肠道微菌群数量无菌收集宰后试验鸡的盲肠内容物，通过平板培养计数法对内容物中双歧杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌及沙门氏菌的数量进行统计，以lg CFU/g表示。1.4数据统计与分析试验数据采用SAS 8.2软件进行单因素方差分析，若存在显著差异采用LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1双歧杆菌对肉鸡生长性能的影响（见表2）由表2可知，21 d时，750 mg/kg组、1 000 mg/kg组肉鸡体重显著高于对照组（P0.05）；42 d时，各试验组肉鸡体重显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.008.T002表2双歧杆菌对肉鸡生长性能的影响项目阶段对照组500 mg/kg组750 mg/kg组1 000 mg/kg组体重/(g/只)1 d43.32±0.0643.31±0.0543.28±0.0643.33±0.0421 d1 087.63±13.81c1 116.18±18.47bc1 143.21±21.42ab1 177.44±26.73a42 d3 284.94±58.46b3 436.47±67.53a3 489.06±66.21a3 527.65±58.90a平均日增重/[g/(只·d)]1~21 d49.73±1.32c51.09±1.28bc52.38±1.63ab54.01±1.75a22~42 d104.63±2.68b110.49±3.15a111.71±3.30a111.92±3.07a1~42 d77.18±1.89b80.79±2.42ab82.04±2.06a82.96±2.51a平均日采食量/[g/(只·d)]1~21 d61.17±1.3660.80±1.1561.81±1.2863.73±1.4722~42 d192.53±2.51b197.78±3.24a197.72±3.16a196.97±2.98a1~42 d126.85±1.96129.29±2.46129.76±2.82130.35±2.75料重比1~21 d1.23±0.04a1.19±0.02ab1.18±0.01b1.18±0.01b22~42 d1.84±0.05a1.79±0.04ab1.77±0.03ab1.76±0.02b1~42 d1.64±0.04a1.60±0.03ab1.58±0.02b1.57±0.02b注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表3、表5与此同。1~21 d时，750 mg/kg组、1 000 mg/kg组肉鸡平均日增重显著高于对照组（P0.05）；22~42 d时，各试验组肉鸡平均日增重显著高于对照组（P0.05）；1~42 d时，750 mg/kg组、1 000 mg/kg组肉鸡的平均日增重显著高于对照组（P0.05）。22~42 d时，各试验组肉鸡平均日采食量均显著高于对照组（P0.05）。1~21 d时，750 mg/kg组、1 000 mg/kg组肉鸡料重比显著低于对照组（P0.05）；22~42 d时，1 000 mg/kg组肉鸡料重比显著低于对照组（P0.05）；1~42 d时，750 mg/kg和1 000 mg/kg组肉鸡料重比显著低于对照组（P0.05）。2.2双歧杆菌对肉鸡血清免疫指标的影响（见表3）由表3可知，各试验组肉鸡血清中IgG和IL-6含量均显著高于对照组（P0.05），IFN-γ显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.008.T003表3双歧杆菌对肉鸡血清免疫指标的影响项目对照组500 mg/kg组750 mg/kg组1 000 mg/kg组IgG/(g/L)0.78±0.18b1.23±0.24a1.45±0.33a1.53±0.36aIgA/(g/L)0.29±0.07b0.33±0.06ab0.39±0.06ab0.45±0.09aIgM/(g/L)0.19±0.05b0.22±0.04ab0.26±0.60ab0.34±0.07aIFN-γ/(ng/L)16.63±1.53a12.48±1.42b12.35±1.58b12.13±1.65bTNF-α/(ng/L)28.52±2.5129.49±2.8031.62±2.6528.96±3.25IL-1/(ng/L)21.32±2.64a19.53±2.17ab18.67±1.85ab16.51±1.43bIL-6/(ng/L)5.57±0.65b8.17±0.93a7.64±0.82a7.80±0.71aIL-10/(ng/L)13.63±1.16a12.86±1.27ab10.16±1.43b11.25±1.63ab1 000 mg/kg组肉鸡血清IgA和IgM含量显著高于对照组（P0.05），血清IL-1含量显著低于对照组（P0.05）。750 mg/kg组肉鸡血清IL-10含量显著低于对照组（P0.05）。2.3双歧杆菌对肉鸡血清抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，1 000 mg/kg组肉鸡血清T-AOC显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.008.T004表4双歧杆菌对肉鸡血清抗氧化指标的影响组别T-AOC/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)CAT/(U/mL)SOD/(U/mL)MDA/(μmol/L)对照组2.85±0.26b256.0±35.3316.15±2.43102.13±14.35b5.67±0.61a500 mg/kg组3.09±0.18ab268.31±24.6217.32±1.97143.57±12.28a4.93.±0.52ab750 mg/kg组3.16±0.20ab271.60±20.2616.83±2.20149.13±14.56a4.27±0.43bc1 000 mg/kg组3.36±0.24a278.05±24.1318.17±3.14154.76±15.48a3.56±0.35bc注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表6与此同。各试验组肉鸡血清SOD活性显著高于对照组（P0.05）。750 mg/kg组、1 000 mg/kg组肉鸡血清MDA含量显著低于对照组（P0.05）。2.4双歧杆菌对肉鸡肠道形态指标的影响（见表5）由表5可知，各试验组肉鸡回肠VH和CD均显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.008.T005表5双歧杆菌对肉鸡肠道形态指标的影响组织项目对照组500 mg/kg组750 mg/kg组1 000 mg/kg组十二指肠VH/μm783.16±53.78828.09±46.17845.67±62.40871.39±58.15CD/μm162.48 ±9.76170.39±12.43170.15±10.70171.87±16.41V/C4.82±0.324.86±0.184.97±0.175.07±0.43空肠VH/μm753.82±46.26748.14±36.50768.68±22.17760.42±38.10CD/μm157.70±11.36157.50±8.90159.81±14.35156.14±10.71V/C4.78±0.414.75±0.354.81±0.184.87±0.27回肠VH/μm683.27±53.46b846.33±78.42a889.61±80.24a927.18±92.35aCD/μm144.45±9.36b173.07±15.78a175.81±16.89a177.28±14.17aV/C4.73±0.474.89±0.385.06±0.425.23±0.512.5双歧杆菌对肉鸡肠道菌群数量的影响（见表6）由表6可知，各试验组肉鸡肠道双歧杆菌数量均显著高于对照组（P0.05），大肠杆菌、沙门氏菌数量均显著低于对照组（P0.05），1 000 mg/kg组肉鸡肠道大肠杆菌、沙门氏菌数量显著低于对照组和500 mg/kg组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.06.008.T006表6双歧杆菌对肉鸡肠道菌群数量的影响组别双歧杆菌大肠杆菌乳酸杆菌沙门氏菌对照组7.57±0.57d7.13±0.39a7.24±0.346.22±0.41a500 mg/kg组9.47±0.62c6.65±0.28b7.35±0.285.54±0.28b750 mg/kg组10.52±0.48b6.26±0.47bc7.30±0.465.31±0.35bc1 000 mg/kg组11.63±0.36a5.84±0.15c7.18±0.264.91±0.27clg CFU/g3讨论3.1双歧杆菌对肉鸡生长性能的影响双歧杆菌是允许用于饲料生产的益生菌之一，但其在畜禽生产中的应用相对缺少。王雪飞等[8]将双歧杆菌胶囊（7.67×107 CFU/g）和苦豆籽粕粉按照12∶1制成合生元对肉鸡进行饲喂，发现2%合生元组肉鸡1~21、22~42、1~42 d的平均日增重均显著低于对照组。Zhang等[9]在AA肉鸡饮水中分别添加1%干酪乳杆菌、1%嗜酸乳杆菌、1%双歧杆菌，结果发现，添加1%双歧杆菌可显著提高雌鸡的试验末体重、平均日增重、平均日采食量。Hernández-Granados等[10]在肉鸡日粮中分别添加0.25 g/kg硫酸黏杆菌素和杆菌肽锌（抗生素组）、1%龙舌兰果聚糖、11.14 lgCFU/g双歧杆菌，结果发现，与抗生素组相比，双歧杆菌组肉鸡的平均日采食量和饲料转化率显著上升。Dev等[11]分别在肉鸡日粮中添加20 mg/kg杆菌肽亚甲基水杨酸酯（T2）、0.1%甘露聚糖+1×106 CFU/g双歧杆菌（T3）、0.1%甘露聚糖+1×107 CFU/g双歧杆菌（T4）、0.2%甘露聚糖+1×106 CFU/g双歧杆菌（T5）和0.2%甘露聚糖+1×107 CFU/g双歧杆菌（T6），结果表明，肉鸡的末重和饲料转化率从高到低依次为T5、T6、T2、T3、T4、对照组。Abou-Kassem等[12]研究发现，日粮中单独添加0.1%水平的双歧杆菌可以显著提高鹌鹑试验末重和平均日增重。本研究表明，日粮中添加双歧杆菌可有效提高肉鸡末重、平均日增重，降低料重比，并显著提升22~42 d的平均日采食量，与上述研究结果基本一致，表明双歧杆菌与其他类别益生菌类似，可以通过改善营养物质消化利用，提高肉鸡的生长性能。3.2双歧杆菌对肉鸡机体免疫功能的影响IgG、IgA和IgM参与机体免疫，可反映机体免疫水平[13]。IFN-γ是可溶性二聚体细胞因子，具有直接杀灭病毒或细菌的作用[14]。TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10是动物机体重要的细胞因子，参与体内炎症反应和免疫细胞活化[15]。Hernández-Granados等[10]研究发现，与对照组相比，双歧杆菌组肉鸡血清IgA含量提升约25%，而抗生素组IgA含量则下降30%，双歧杆菌组肉鸡血清IL-10、IFN-γ、IL-1β含量显著低于对照组。El-Sharkawy等[16]研究表明，感染沙门氏菌的肉鸡每日口服2×109 CFU/mL双歧杆菌可有效减少肉鸡体内TNF-α和IFN-γ合成，抑制沙门氏菌的增殖。本研究表明，日粮中添加双歧杆菌可增加肉鸡血清中免疫球蛋白含量，减少细胞因子合成，与上述研究结果基本一致，表明双歧杆菌可调节肉鸡机体免疫，减少炎症因子的合成，降低体内炎症反应。3.3双歧杆菌对肉鸡血清抗氧化指标的影响T-AOC是反映机体整体抗氧化能力的重要指标，GSH-Px、SOD、CAT等是体内重要的抗氧化酶，保护机体免受自由基损伤。MDA是体内脂质代谢产物，可以直接反映体内脂类物质的过氧化程度[17]。Zhang等[9]研究表明，日粮中添加1%双歧杆菌可显著增加GSH-Px和SOD活性，显著降低血清MDA含量。Mohammed等[18]分别在基础日粮中添加0.5、1.0 g/kg以双歧杆菌为主的复合益生菌制剂对肉鸡进行饲喂，结果发现，该复合益生菌能够显著提高肉鸡生长性能和血清GSH-Px活性。本研究认为，日粮中添加双歧杆菌可以显著增加血清T-AOC和SOD活性，减少血清MDA含量，与上述研究结论基本类似，表明日粮中添加双歧杆菌可显著提升肉鸡机抗氧化能力，提升肉鸡健康水平。3.4双歧杆菌对肉鸡肠道形态指标的影响肠道形态与肉鸡肠道功能和健康密切相关[19]。El-Moneim等[20]在孵化过程中分别将鸡蛋内部注入1×107、1×109 CFU/g双歧杆菌，并以益生菌溶剂作为对照组注射至鸡蛋内，孵化后检测肉鸡肠道组织形态，结果表明，与对照组相比，试验组肉鸡VH和V/C均显著高于对照组。Zhang等[21]在P1组、P2组、P3组分别在饮水中添加1%干酪乳杆菌、1%嗜酸乳杆菌、1%双歧杆菌，CP1组、CP2组、CP3组分别在饮水中添加2%的3种益生菌混合制剂，比例依次为2∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2，结果表明，与对照组相比，所有试验组肉鸡VH和CD均显著高于对照组，与本研究的结论一致，可能是由于双歧杆菌可减少分解毒素，降低肠道炎症，提高肠道健康水平，促进肠道发育使其更易于吸收营养物质消化吸收。3.5双歧杆菌对肉鸡肠道微生物数量的影响肠道菌群结构是影响肠道功能和机体健康的重要因素，维持肠道微生态平衡是提升肉鸡生长性能和鸡群健康水平的基础[22]。Zhang等[9]研究表明，添加1%双歧杆菌可显著降低肠道中沙门氏菌和大肠杆菌数量，促进乳酸杆菌增殖。Khabirov等[23]在肉鸭日粮中添加含有8×107 CFU/g双歧杆菌的复合益生菌制剂，结果表明，该益生菌制剂显著提高了肉鸭的平均日增重和末重，增加肠道中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量，减少肠道中大肠杆菌数量。Baffoni等[24]连续14 d为肉鸡补充109 CFU双歧杆菌制剂后发现，肠道中弯曲菌属微生物数量显著下降。因此，日粮中添加双歧杆菌可以竞争性地抑制病原微生物，并促进益生菌增殖，加强肠道健康。4结论本研究结果表明，添加双歧杆菌可提高肉鸡生长性能、机体抗氧化与免疫能力，改善肠道形态，调节肠道内微生物数量，建议在日粮中添加750 mg/kg双歧杆菌。