我国2020年7月1日起全面禁止在日粮中添加药物饲料添加剂（中草药除外），畜禽饲料中替抗限抗养殖技术逐渐成为研究热点问题，研发更多安全、绿色、高效、污染小的抗生素替代产品是畜禽养殖产业的发展方向。牛大力是药食两用植物，为豆科崖豆藤属美丽崖豆藤，含有多糖、生物碱、甾醇类、酮类和多种微量元素等成分，对机体具有免疫调节作用，是理想的免疫增强剂[1]；具有镇痛镇静、解痉、镇咳平喘祛痰的作用[2]，还具有保肝[1]、抗疲劳[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、抗辐射[6]、降血脂[7]等功能。陈杨超等[8]研究发现，牛大力超微细粉能够提高产蛋后期蛋鸡的平均日增重。李祟等[9]研究表明，牛大力多糖可预防动物感染多重耐药大肠杆菌类疾病，提高机体免疫功能。朱永健等[10]采用牛大力多糖配合鸡IBDV VP2蛋白对雏鸡进行免疫发现，牛大力多糖能够显著提高雏鸡体重。目前，牛大力多糖在猪生产中尚未见报道。海南猪是我国著名的地方猪品种，具有抗病力强、繁殖率高和肉质好等优点。本试验探究日粮中添加牛大力多糖对育肥期海南猪生长性能、血清生化指标、免疫指标及肠道菌群的影响，为牛大力多糖作为绿色饲料添加剂在海南猪生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料牛大力多糖购自西安某生物科技有限公司，纯度为50%，主要的活性成分为鼠李糖、岩藻糖、果胶糖、五碳醛糖等；玉米、豆粕等原料购自海南饲料原料市场。基础日粮参考《猪饲养标准》（NY/T 65—2004）配制，基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.006.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米71.60消化能/(MJ/kg)13.03豆粕10.80粗蛋白/%13.00麦麸13.60钙/%0.48预混料4.00总磷/%0.48亮氨酸/%1.06蛋氨酸/%0.23赖氨酸/%0.56苏氨酸/%0.49色氨酸/%0.16注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 43 000 IU、VE 587 IU、VK3 12.5 mg、VD3 1 100 IU、VB2 240 mg、VB6 52.5 mg、VB3 725 mg、泛酸钙437 mg、Fe 1 200 mg、Se 2.5 mg、Zn 1 200 mg、Cu 150 mg、Mn 300 mg、I 6 mg。2.营养水平均为计算值。1.2试验设计及饲养管理选取体重（68.11±1.20）kg、健康状况良好的海南猪32头，随机分为2组，即对照组和牛大力多糖组，每组4个重复，每个重复4头猪。对照组猪饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中添加0.1%牛大力多糖。预试期7 d，正式试验期70 d。试验猪自由采食和饮水，按照常规程序进行消毒和免疫。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能试验开始和结束时，试验猪8：00称重，禁食12 h；试验期间称剩料重，计算平均日采食量、平均日增重和料重比。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(1)平均日采食量=平均饲料耗料量/试验天数(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.3.2血清生化及免疫指标试验结束后，每组选取6头接近平均体重的海南猪，前腔静脉采集血液，取5 mL血液注入干燥的真空采血管中，于室温倾斜静置30 min，3 000 r/min离心15 min制备血清，保存在-80 ℃冰箱中。血清生化指标包括：血清葡萄糖（GLU）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、γ-谷氨酰基转移酶（γ-GT）、谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST），使用日立LABOSPECT008AS全自动生化分析仪进行检测。免疫指标包括：血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α），采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行检测。1.3.3肠道菌群屠宰后采集海南猪的结肠内容物于冻存管中，用液氮急冷冻后保存在-80 ℃冰箱。使用PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒提取结肠微生物DNA，以总DNA为模板，采用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAG-CAG-3'）和806R（5'-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3'）扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区，在Illunmina Miseq PE300高通量测序分析，委托北京奥维森基因科技有限公司完成检测工作。肠道菌群测序下机数据经过QIIME1（v1.8.0）软件根据Barcode序列拆分样本，使用Pear（v0.9.6）软件对数据进行处理得到优化序列，利用Vsearch（v2.7.1）软件uparse算法对优质序列进行OTU聚类，相似性阈值为97%。与Silva128数据库使用RDP Classifier算法进行比对，置信度阈值设置为70%，得到每个OTU对应的物种分类信息，利用QIIME1（v1.8.0）软件进行α多样指数分析。物种注释及相对丰度结果采用使用R（v3.6.0）软件进行物种组成柱状图分析。使用QIIME1（v1.8.0）计算beta多样性距离矩阵，并基于Weighted Unifrace距离使用R（v3.6.0）软件进行PCoA分析。1.4数据统计与分析数据采用Excel软件进行整理，SPSS 20.0软件进行独立样本t检验，GraphPad Prism软件进行柱状图绘制。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1牛大力多糖对育肥期海南猪生长性能的影响（见表2）由表2可知，添加0.1%的牛大力多糖具有提高育肥期海南猪的末重和平均日增重、降低料重比的趋势，但差异均不显著（P0.05）。与对照组相比，牛大力多糖组试验猪的平均日采食量显著降低了1.30%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.006.T002表2牛大力多糖对育肥期海南猪生长性能的影响项目初重/(kg/头)末重/(kg/头)平均日增重/[g/(头·d)]平均日采食量/[g/(头·d)]料重比P值0.2310.4680.7410.0250.601对照组67.97±0.95117.04±1.39697.62±31.763 207.62±6.43a4.59±0.19牛大力多糖组68.78±0.76118.63±3.13707.74±37.733 166.01±17.93b4.50±0.20注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表5与此同。2.2牛大力多糖对育肥期海南猪血清生化指标的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，牛大力多糖组猪血清HDL-C含量显著提高（P0.05），TG含量和ALT活性显著降低（P0.05）。添加0.1%牛大力多糖猪血清GLU含量具有增加的趋势（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.006.T003表3牛大力多糖对育肥期海南猪血清生化指标的影响项目对照组牛大力多糖组P值TC/(mmol/L)2.27±0.172.24±0.290.810TG/(mmol/L)0.61±0.11a0.45±0.09b0.047γ-GT/(U/L)41.75±9.5738.25±9.170.617ALT/(U/L)51.60±6.77a46.75±16.99b0.024AST/(U/L)113.75±8.2273.25±46.650.138TP/(g/L)75.14±2.0875.60±5.010.854ALB/(g/L)35.96±2.4335.04±3.960.670HDL-C/(mmol/L)0.47±0.04b0.61±0.11a0.046LDL-C/(mmol/L)1.34±0.111.28±0.190.555GLU/(mmol/L)4.50±0.415.68±1.030.078注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4与此同。2.3牛大力多糖对育肥期海南猪血清免疫指标的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，牛大力多糖组育肥期海南猪血清中IgG、IgM、IgA和TNF-α的含量均显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.006.T004表4牛大力多糖对育肥期海南猪免疫功能的影响项目对照组牛大力多糖组P值LgG/(g/L)3.19±1.01b7.60±3.64a0.034lgA/(g/L)2.31±0.62b3.89±0.91a0.017lgM/(g/L)4.22±1.90b13.35±3.02a0.002IL-2/(ng/L)130.44±34.15130.36±48.590.998TNF-α/(ng/L)41.52±30.58b138.00±31.14a0.0012.4牛大力多糖对育肥期海南猪肠道菌群的影响2.4.1育肥期海南猪结肠菌群OTU分析（见图1）由图1可知，育肥期海南猪结肠内容物检出4 036个OTU，其中对照组和牛大力多糖组共有1 856个OTU，占45.98%，对照组独有798个OTU，牛大力多糖组独有1 382个OTU。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.006.F001图1育肥期海南猪结肠菌群的韦恩图注：CONT为对照组，BMRB为牛大力多糖组；下图同。2.4.2育肥期海南猪结肠菌群α多样性分析（见表5）α多样性分析可反映微生物群落的丰富性和多样性。由表5可知，两组的覆盖率指数均为0.99，表明测序的深度和广度合理。与对照组相比，牛大力多糖组的Chao1指数显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.006.T005表5育肥期海南猪肠道菌群α多样性分析项目Chao1指数Shannon指数Simpson指数Coverage覆盖率P值0.0170.5310.751—对照组1 644.84±92.52a7.07±0.700.95±0.040.99牛大力多糖组1 442.87±100.77b6.79±0.690.94±0.0502.4.3育肥期海南猪结肠菌群结构差异分析（见图2）为了解两组海南猪结肠菌群的差异，在OTU水平上对样品进行PCoA分析。由图2可知，试验组间可区分，属包含关系，组间微生物群落组成差异不明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.006.F002图2育肥期海南猪结肠菌群PCoA分析结果2.4.4育肥期海南猪结肠菌群在门水平、科水平和属水平上的组成（见图3）由图3可知，在门水平上，对照组和牛大力多糖组的相对丰度大于3%的优势菌群是厚壁菌门、拟杆菌门、螺旋体菌门。在科水平上，各组相对丰度大于3%的优势菌群是链球菌科、毛螺菌科、Muribaculaceae、理研菌科、普雷沃菌科、颤螺旋菌科、消化链球菌科、梭菌科、螺旋体科。在属水平上，各组相对丰度大于3%的优势菌群是链球菌、未培养菌、理研菌科RC9肠道菌群、普雷沃氏菌、梭状芽孢杆菌（Clostridium_sensu_stricto_1）、普雷沃氏菌科UCG-003菌属（Prevotellaceae UCG_003）、未知菌。图3育肥期海南猪结肠菌群在门、科、属水平上的组成10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.006.F3a1（a）门水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.006.F3a2（b）科水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.006.F3a3（c）属水平2.4.5育肥期海南猪结肠菌群在门水平、科水平和属水平的差异（见图4）为进一步了解2个试验组结肠内容物菌群差异情况，利用Kruskal-Wallis秩和检验方法分析在门、科和属水平上的丰度大于0.1%的肠道菌群。由图4可知，在门水平上，与对照组相比，牛大力多糖组的脱硫菌门相对丰度显著降低（P0.05）。在科水平上，与对照组相比，牛大力多糖组的普雷沃菌科相对丰度显著升高（P0.05），Muribaculaceae、肠杆菌科、脱硫弧菌科的相对丰度显著降低（P0.05）。在属水平上，与对照组相比，牛大力多糖组的普雷沃氏菌、拟普雷沃菌、梭状芽孢杆菌6（Clostridium_sensu_stricto_6）、丁酸厌氧杆菌、高氏瘤胃球菌群（Ruminococcus_gauvreauii_group）、粪球菌属、月形单胞菌属、布劳特氏菌属（Blautia、Marvinbryantia）的相对丰度显著上调（P0.05），大肠志贺氏杆菌（Escherichia_Shigella）、脱硫弧菌属、Shuttleworthia的相对丰度显著下调（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.006.F004图4育肥期海南猪结肠内容物菌群在门、科和属水平的差异2.4.6血清脂质代谢相关指标与属水平的差异菌群的关联性分析（见图5）运用斯皮尔曼算法分析了血清脂质代谢相关指标与属水平上差异肠道微生物群落的相关性热图。正相关用红色方块表示，红色越深，相关系数越高；负相关用蓝色方块表示，蓝色越深，相关系数越高。由图5可知，Marvinbryantia、粪球菌属的相对丰度与HDL-C、TG、TC呈正相关，大肠志贺氏杆菌（Escherichia_Shigella）、脱硫弧菌的相对丰度与HDL-C呈负相关。Marvinbryantia的相对丰度与HDL-C呈显著正相关（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.006.F005图5育肥期海南猪血清脂质代谢指标与肠道菌群的关联性分析热图注：“*”表示差异显著（P0.05）。3讨论3.1牛大力多糖对育肥期海南猪生长性能的影响在畜禽日粮中添加适宜剂量的植物多糖可以改善动物肠道健康，提高生长性能[11]。孙洲等[12]研究表明，在日粮中添加茯苓多糖能够显著提高仔猪末重、平均日增重及平均日采食量。彭宏刚[13]发现，在生长育肥猪日粮中添加黄芪多糖具有促进猪生长的趋势，适宜添加量为0.2%~0.3%。也有研究发现，在日粮中添加复合多糖可显著降低肉鸡的平均日采食量和料重比[14]。植物多糖可通过调控NF-κB、MAPK、JAK/STAT等信号通路增强肠道各屏障的生理功能，加强各屏障之间的相互联系，预防畜禽肠道疾病发生，降低肠道炎症水平，维持肠道菌群动态平衡，提高养分吸收，动物的生长发育和生产性能得以改善[15-16]。本研究结果显示，与对照组相比，牛大力多糖组的平均日采食量显著降低，末重和平均日增重均有所提高，可能是因为牛大力多糖含有丰富的氨基酸、维生素、未知的生长因子等营养成分，或是牛大力多糖提高了肠道有益菌群的丰度，抑制了有害菌群的定植，改善了肠道对养分的吸收，同时牛大力的特殊药味降低了日粮的适口性。3.2牛大力多糖对育肥期海南猪血清生化指标的影响机体血清中TC和TG的含量可反映机体内脂类合成和代谢之间的平衡，LDL-C在机体内充当TC载体，其含量可以代表TC的沉积能力，HDL-C可代表清除机体内TC的能力，血清GLU是机体生命活动最直接最重要的能量来源。本研究发现，与对照组相比，牛大力多糖能够显著降低血清中TG的含量，提高HDL-C的含量，降低TC和LDL-C的含量，但差异均不显著，表明牛大力多糖具有改善血清脂质代谢的潜力；牛大力多糖组的GLU含量具有增高的趋势。宫汝淳等[17]研究发现，在育成期蛋鸡日粮中添加桑黄多糖能够显著降低血清中TG和LDL-C的含量，可能与桑黄多糖降低血清ALT和AST的活性，提高肝脏的代谢能力有关。本试验发现，牛大力多糖显著降低了血清ALT活性，AST和γ-GT的活性也有所降低。周添浓等[18]研究发现，牛大力具有保护肝脏的作用，能够降低小鼠AST和ALT活性，减少肝丙二醛（MDA）含量，降低肝脏指数，提高胸腺指数。赵小宁[19]研究发现，牛大力水提取物能够显著性降低游泳后小鼠血浆TG和BUN含量，提高肌糖原含量；牛大力粗多糖能够显著提高小鼠体内GLU含量，可能是牛大力多糖能调节机体，增加机体对脂类物质的消耗以及糖原的储藏或者减少对糖原物质的利用。3.3牛大力多糖对育肥期海南猪血清免疫指标的影响动物免疫应答与免疫球蛋白密切相关。血清IgA具有某些IgG和IgM的免疫功能，特异性IgA可中和血液中的抗原，同时也出现替代性补体免疫系统[20]；IgM作为天然抗体的主要成分，主要由B淋巴细胞产生，具有杀菌、激活补体、免疫调理和凝集作用[21]；IgG是在脾脏和淋巴结中合成、血清中含量最丰富的蛋白质之一，是抗细菌、抗毒素和抗病毒抗体的主要组成部分，也是动物机体抗感染免疫过程中的重要物质基础[22]。日粮中添加300 mg/(kg·BW)桑黄多糖能够提高育成期蛋鸡血清IgG、IgA和IgM含量，表明桑黄多糖通过调节髓样分化因子以及TNF-α相关受体进行免疫调节[17]。本研究发现，在海南猪日粮中添加0.1%牛大力多糖能够显著提高血清IgG、IgA、IgM和TNF-α含量。谢婵等[23]研究发现，牛大力对免疫抑制小鼠具有一定的免疫功能增强作用。Chen等[24]研究发现，牛大力多糖可减轻CTX所致小鼠体重和免疫器官指数的下降，促进免疫相关细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α和IgG分泌。李祟等[9]研究发现，牛大力多糖能够上调Lbp、Vrnil、I133等与免疫功能具有重要作用的基因表达，还可下调与炎症反应有关的某些基因表达，能够作用于To11样受体信号通路、TNF信号通路、T细胞受体信号通路等与免疫功能具有重要联系的通路。王柳萍等[25]报道，适量水平的牛大力多糖可增强ConA诱导的小鼠T淋巴细胞增殖作用，对TNF-α和IL-6的产生具有促进作用，对前列腺素E2具有抑制作用。3.4牛大力多糖对育肥期海南猪肠道菌群的影响肠道菌群参与机体的消化吸收，还可起保护肠道、刺激免疫等功能[26]，维持肠道稳态，更好地发挥消化吸收以及转运作用。本研究结果表明，日粮中添加牛大力多糖可使海南猪肠道菌群发生变化，牛大力多糖组的Chao1指数显著降低，肠道菌群物种减少。刘香凝等[14]在肉鸡日粮中添加复合多糖，发现Chao1指数显著降低，本研究结果与之相似。本研究中，在门水平上，牛大力多糖组的厚壁菌门相对丰度降低，拟杆菌门的相对丰度升高，脱硫菌门的相对丰度显著降低。拟杆菌门中的一些菌群则会参与糖类代谢与运输的菌群，为宿主提供能量，进而促进宿主生长[27]。本研究中，在科水平上，牛大力多糖组的普氏菌科相对丰度显著升高，Muribaculaceae、肠杆菌科、脱硫弧菌科的相对丰度显著降低。普氏菌科是一种短链脂肪酸（SCFAs）产生菌，可维持肠道屏障的完整性和稳定性，促进胃肠道蠕动[28]。研究发现，大鼠肠道中Muribaculaceae菌属丰度增加会导致肠道菌群紊乱[29]。本研究中，在属水平上，两组链球菌的相对丰度最高；链球菌是机会致病菌，对猪的发病存在潜在诱导作用[30]。在整个试验过程中，猪均未发病，可能与海南猪抗逆性强有关，具体的机制还需要进一步研究。在日粮中添加牛大力多糖显著降低了脱硫弧菌从门到属水平的相对丰度，而脱硫菌门菌的代谢产物会引起肠道炎症反应，扰乱肠道能量代谢[31]；牛大力多糖组的有害菌埃希氏志贺氏菌的相对丰度显著降低，普雷沃氏菌、拟普雷沃菌、Clostridium_sensu_stricto_6、丁酸厌氧杆菌、Ruminococcus_gauvreauii_group、粪球菌属、月形单胞菌属、Blautia、Marvinbryantia的相对丰度显著提高。Zhou等[32]通过体外发酵试验发现，枸杞花蜂粉多糖可有效提高普雷沃氏菌、降低埃希氏志贺氏菌、梭状芽孢杆菌（Clostridium_sensu_stricto）和拟普雷沃菌的相对丰度，与本研究结果部分相似。牛大力多糖含有丰富的鼠李糖、岩藻糖、果胶糖、五碳醛糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等[33]，普雷沃氏菌具有发酵纤维二糖、葡萄糖和果糖的能力[34]，参与多糖的分解消化吸收。龙须菜多糖能够有效促进肠道内产生SCFAs细菌，如粪球菌属_1（Coprococcus_1）、未分类f型瘤胃球菌科（uncultured_bacterium_f_Ruminococcaceae）的生长，并增加粪便中水分含量和丙酸、丁酸和戊酸等SCFAs含量，有助于维持肠道健康[35]。拟普雷沃菌亦属于拟杆菌门，可产生SCFAs[36]，丁酸厌氧杆菌和瘤胃球菌属、Blautia、Marvinbryantia也可产生丁酸盐等SCFAs，能够增强抗炎效果[37-40]。SCFAs在胃肠道中具有调控脂肪储备的作用，通过抑制肝脏脂肪酸合成酶（FAS）的活性降低血清TG与TC含量[41]。因此，牛大力多糖可优化育肥期海南猪结肠菌群的组成，促进有益菌生长，抑制有害菌的增殖，改善肠道健康。肠道菌群组成与结构的改变，与血脂变化具有密切关系[42]。Fu等[43]研究发现，粪球菌属与TG水平密切相关，梭菌科和毛螺菌科的比例与LDL-C的含量相关。有研究报道，梭菌属释放胆盐水解酶作用于胆盐的酰胺键，反应生成甘氨酸或牛磺酸以及游离胆汁酸，对胆盐进行修饰，能够有效降低血清TC含量[44]。本研究通过对属水平差异菌群与血清脂质代谢相关指标进行关联性分析，结果显示，Marvinbryantia、Coprococcus的相对丰度与HDL-C、TG、TC呈正相关，Escherichia_Shigella、脱硫弧菌的相对丰度与HDL-C呈负相关，Marvinbryantia的相对丰度与HDL-C呈显著正相关。Marvinbryantia的相对丰度与肠上皮细胞能量代谢和丁酸盐产生呈正相关[45]。牛大力多糖通过肠道菌群对血清TG和HDL-C的含量产生影响，这也可能与脂质代谢相关基因的表达和相关酶活性有关，具体机制需进一步研究。4结论本研究表明，日粮中添加0.1%牛大力多糖能够降低育肥期海南猪平均日采食量，改善血清脂质代谢，提高机体免疫力，优化结肠菌群结构，促进有益菌的生长和抑制有害菌的增殖。